Caenorhabditis चलनी: छोटे कोशिकीय जीवों की छंटाई के लिए एक कम तकनीक साधन और कार्यप्रणाली
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल छंटाई और उंर की सफाई Caenorhabditis एलिगेंस के मिलान आबादी के लिए एक पद्धति भी शामिल है । यह एक सरल, सस्ती और कुशल कस्टम उपकरण का उपयोग करता है अनुसंधान के लिए सूत्रकृमि की एक बड़ी प्रयोगात्मक जनसंख्या प्राप्त करने के लिए ।
Abstract
Caenorhabditis एलिगेंस (C. एलिगेंस) एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान की एक श्रेणी में इस्तेमाल किया जीव है । निमेटोड अनुसंधान समुदाय के भीतर, वहां एक किफायती और प्रभावी तरीका है, सी एलिगेंसके बड़े उंर मिलान आबादी बनाए रखने के लिए एक की जरूरत है । यहां, हम यांत्रिक छंटाई और सी एलिगेंससफाई के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं । हमारा उद्देश्य एक लागत प्रभावी, कुशल, तेज, और सरल करने के लिए एक समान आकार और प्रयोगों में उनके उपयोग के लिए जीवन चरणों के पशुओं को प्राप्त करने की प्रक्रिया प्रदान करना है । इस उपकरण, Caenorhabditis छलनी, एक कस्टम निर्मित ढक्कन प्रणाली का उपयोग करता है कि आम शंकु लैब ट्यूबों पर धागे और शरीर के आकार के आधार पर सी एलिगेंस तरह । हम यह भी है कि Caenorhabditis चलनी प्रभावी ढंग से एक संस्कृति थाली से एक और एक तेजी से छंटाई, तुल्यकालन के लिए अनुमति के लिए पशुओं के हस्तांतरण, और गतिशीलता और तनाव सहित स्वास्थ्य के मार्करों प्रभावित बिना सफाई-inducible जीन पत्रकारों । यह सुलभ और अभिनव उपकरण एक तेज, कुशल, और गैर सी एलिगेंस आबादी बनाए रखने के लिए विकल्प तनावपूर्ण है ।
Introduction
निमेटोड कीड़ा, Caenorhabditis एलिगेंस, एक प्रमुख मॉडल जीव है । प्रयोगशाला में उनकी खेती की सीधी और नियंत्रित प्रकृति के अलावा, उनके पूरे जीनोम का अनुक्रम1 है और प्रत्येक कोशिका के विकासात्मक भाग्य को2जाना जाता है. इन सुविधाओं के कारण, सी एलिगेंस आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल जीव है । हालांकि, इन लाभकारी विशेषताओं के साथ साथ शोधकर्ताओं के लिए कुछ चुनौतियां आती हैं । उनके तीव्र पीढ़ी के समय के कारण, C. एलिगेंस आबादी जल्दी से भोजन से बाहर चला सकते हैं और/या कई पीढ़ियों और विकासात्मक एक बार में मौजूद चरणों के साथ मिश्रित आबादी बन जाते हैं । इस प्रकार, ठोस निमेटोड विकास मीडिया (NGM) पर प्रदर्शन प्रयोगों के लिए शोधकर्ताओं को शारीरिक रूप से ताजा प्लेटों के लिए जीवाणु खाद्य स्रोत घट जाती है और नए लार्वा विकसित करने से पहले स्थानांतरित करने की आवश्यकता है । यह पशुओं के लगातार स्थानांतरित करने के रूप में थकाऊ हो सकता है वंश पीढ़ियों के साथ मिश्रित बनने से प्रयोगात्मक आबादी को रोकने के लिए आवश्यक है । फिर भी, कुछ प्रयोगों दोनों बड़ी संख्या में पशुओं की आवश्यकता होती है और विस्तारित समय अंक (जैसे, वयस्कता में डीएनए या आरएनए निष्कर्षण). इस यौगिकों सही एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या को बनाए रखने और पशुओं की बड़ी संख्या में स्थानांतरित की चुनौतियों ।
NGM पर एलिगेंस कल्चर्ड स्थानांतरित करने के वर्तमान तरीके उठा रहे हैं या प्लेट से जानवरों को प्लेट से धो रहे हैं; रासायनिक जानवरों के इलाज (जैसे, डीएनए प्रतिकृति अवरोध करनेवाला fluorodeoxyuridine या FUDR के साथ); या प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए बहु अच्छी तरह से प्लेटों में जानवरों की तरह । उठा एक हाथ उपकरण का उपयोग शामिल है, या तो एक पतली प्लैटिनम तार या एक बरौनी के साथ बनाया, को मैंयुअल रूप से व्यक्तिगत या कई पशुओं के हस्तांतरण3,4। इस विधि सही है, लेकिन दोनों कौशल और समय की आवश्यकता है और पशुओं की बड़ी संख्या को शामिल अध्ययन के लिए एक सीमा है । उठा भी शारीरिक रूप से हानिकारक और संभावित रूप से अशांति और बल के अप्राकृतिक और असंगत मात्रा के लिए व्यक्तियों को subjecting द्वारा पशुओं के लिए तनावपूर्ण हो सकता है । धुलाई एक बफर समाधान के साथ एक संस्कृति पकवान धोने शामिल है और एक नई संस्कृति प्लेट को कांच पाश्चर पिपेट के माध्यम से पशुओं के साथ समाधान स्थानांतरित । इस विधि तेजी से और कुशल है, लेकिन कई पीढ़ियों और पशुओं के विकास के चरणों के रूप में सटीक नहीं है थोक में स्थानांतरित कर रहे हैं । ऐसे FUDR के रूप में रासायनिक उपचार, संवर्धन मीडिया में भंग किया जा सकता है किसी भी डीएनए प्रतिकृति अवरुद्ध के माध्यम से वंश के उत्पादन को रोकने के लिए, और इस प्रकार, gamete उत्पादन और अंडा विकास । जबकि प्रभावी, इस विधि के रूप में विकासात्मक परिपक्वता के बाद लागू किया जाना चाहिए सामांय विकास प्रक्रियाओं को बाधित नहीं है, और इसका मतलब यह है कि वहां अभी भी एक आवश्यकता के लिए अपने प्रशासन3से पहले पशुओं के हस्तांतरण है । इस विधि भी कई सेलुलर संकेत रास्ते को प्रभावित करता है, जानवरों पर ध्यान देने योग्य प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में वे उंर (जैसे, एक उंर विस्तार या एक बदल proteostasis) C. एलिगेंस के तनाव के आधार पर5इस्तेमाल किया, 6,7,8,9,10. प्रवाह cytometry तरीकों स्वचालित रूप से सॉर्ट और एक बहु-अच्छी थाली से एक और11के लिए व्यक्तिगत सी एलिगेंस हस्तांतरण । हालांकि इस विधि बहुत प्रभावी और कुशल है, प्रवाह cytometry उपकरण नकारात्मक स्तर तक महंगा है और कई शोधकर्ताओं के लिए दुर्गम है । स्थानांतरित करने के लिए एक विकल्प के उत्परिवर्ती मॉडल है कि तापमान संवेदनशील हैं, जैसे fer-15 और फेम-1, जो तापमान समायोजन12के साथ बाँझ हो जाते हैं का उपयोग करने के लिए है । जबकि उत्परिवर्ती जानवरों का उपयोग कुछ स्थितियों में उपयोगी है, इन विशिष्ट उपभेदों जंगली प्रकार के पशुओं की तुलना में धीमी हो जाना और वे एक बदल जीनोम पर भरोसा करते हैं, उंर बढ़ने या स्वस्थ कीड़े के लिए गरीब प्रतिनिधियों के रूप में सेवारत । इसके अलावा, एक तापमान पर निर्भरता के लिए एक स्थिर वातावरण के अभाव में बाँझ भी परिणाम प्रेरित करने के लिए बदलाव, और तापमान परिवर्तन किया गया है आसानी से जीन अभिव्यक्ति13,14को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, 15. अनुसंधान समूहों पहले आकार16से फ़िल्टर C. एलिगेंस करने के लिए एक जाल के उपयोग का वर्णन तकनीक प्रकाशित किया है । हालांकि, हम इस तरह के फिल्टर के उपयोग के साथ जुड़ा हो सकता है कि समग्र स्वास्थ्य परिणामों में किसी भी परिवर्तन के लिए पिछले काम परीक्षण खोजने में असमर्थ थे.
वहां है, इस प्रकार, एक किफायती, कुशल, तेजी से और संस्कृति प्लेटों के बीच पशुओं की बड़ी संख्या में स्थानांतरित करने के लिए सही विधि के लिए सी एलिगेंस अनुसंधान समुदाय के भीतर की जरूरत है । हम एक सुधार, उपकरणों का सुलभ टुकड़ा विकसित किया है ( Caenorhabditis छलनी नाम) और इसके निर्माण और आपरेशन कि सी एलिगेंस अनुसंधान समुदाय की जरूरतों को पूरा करने के लिए एक संबद्ध प्रोटोकॉल । इस के साथ साथ, हम Caenorhabditis छलनी और इसके उपयोग के लिए तरीकों के डिजाइन का हिस्सा है, और हम प्रदर्शित करता है कि इसके उपयोग आम स्वास्थ्य या किसी भी तनाव मार्करों जब मानक मैनुअल उठा और आमतौर पर इस्तेमाल के साथ एक इलाज की तुलना में प्रभाव नहीं पड़ता, प्रजनन-रासायनिक FUDR सीमित ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ, हम छंटाई और सी एलिगेंसबनाए रखने के लिए एक उपकरण के रूप में सुलभ, प्रभावी Caenorhabditis छलनी के डिजाइन और उपयोग की शुरुआत की । इस उपकरण को मैंयुअल रूप से व्यक्तिगत पशुओं उठा, आबादी, रासायनिक उप…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अध्ययन डिजाइन करने के लिए उसे प्रारंभिक योगदान के लिए हीथ Currey शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डॉ स्वरूप मित्रा । हम भी टिप्पणी, शोधन और इस पद्धति के प्रदर्शन के उत्पादन में सहायता के लिए डॉ माइकल बी हैरिस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र है, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई । इस प्रकाशन में सूचित अनुसंधान राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के पुरस्कार संख्या UL1GM118991, TL4GM118992, या RL5GM118990 के तहत और एक संस्थागत विकास पुरस्कार से (विचार) द्वारा समर्थित किया गया था नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के राष्ट्रीय संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के अंतर्गत अनुदान संख्या 5P20GM103395-15. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । UA एक ए. ए./ईओ नियोक्ता और शैक्षिक संस्थान है और किसी भी व्यक्ति के खिलाफ अवैध भेदभाव प्रतिबंधित: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination ।
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
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