꼬마 체: 낮은 악기와 작은 Multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론
Summary
정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.
Abstract
꼬마 선 충 (C. 선 충)은 기본 및 생물 의학 연구의 범위에 걸쳐 사용 되는 기초가 튼튼한 모델 유기 체. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 C. 선 충의 큰, 나이 일치 하는 인구를 유지 하는 저렴 하 고 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 기계적으로 정렬 및 청소 C. 선 충에 대 한 방법론을 제시. 우리의 목표는 동물의 균일 한 크기와 실험에 그들의 사용에 대 한 생활 단계를 비용 효과적, 효율적, 빠르고 간단한 프로세스입니다. 이 도구, 꼬마 체 사용 사용자 뚜껑 시스템을 일반적인 원뿔 실험실 튜브에 스레드 및 선 충 C. 신체 크기에 따라 정렬 합니다. 우리 또한 그 꼬마 체 효과적으로 동물에서에서 전송 하나의 문화 접시는 빠른 정렬, 동기화, 및 건강의 표시를 영향을 주지 않고 청소에 대 한 다른 허용 보여 운동 성 포함 하 고 스트레스를 유도할 수 있는 진 기자입니다. 이 접근 가능 하 고 혁신적인 도구 C. 선 충 인구를 유지 하기 위한 빠르고, 효율, 비-스트레스 옵션입니다.
Introduction
선 충 벌레, 꼬마 선 충, 최고의 모델 생물 이다. 실험실에 있는 그들의 경작의 간단 하 고 제어 특성, 뿐만 아니라 그들의 전체 게놈 시퀀스1 이며 각 셀의 개발 운명2알려져 있다. 이러한 기능을 구현, C. 선 충 유전자 연구에 대 한 널리 사용 되는 모델 생물 이다. 그러나, 이러한 유익한 특성 함께 연구자에 대 한 몇 가지 과제를 올. 그들의 빠른 생성 시간 때문에 C. 선 충 인구 음식에서 신속 하 게 실행할 수 있습니다 또는 여러 세대와 인구 혼합 되 고 발달 단계를 한 번에 제시. 따라서, 고체 선 충 성장 매체 (NGM)에서 수행 하는 실험 연구자 세균 식량 고갈 시키고 새로운 애벌레 개발 하기 전에 물리적으로 신선한 번호판 동물 이동에 필요 합니다. 이 자식 세대와 혼합 되 고에서 실험적인 인구를 방지 하는 데 필요한 동물의 빈번한 전송 지루한 될 수 있습니다. 아직도, 실험 동물 및 확장된 시간 포인트 (예, 성인 기에 DNA 또는 RNA 추출)의 둘 다 다 수 필요합니다. 이 정확 하 게 동기화 된 인구를 유지 하 고 전송 하는 동물의 많은 수의 문제 화합물.
C. 선 충 NGM에서 양식 전송의 현재 방법 따기 또는 세척 동물 격판덮개; 화학적 치료 동물 (예를들면, DNA 복제 억제 물 fluorodeoxyuridine 또는 FUDR); 또는 cytometry 정렬 다 잘 판에 동물을 사용 하 여. 따기 개인 또는 여러 동물3,4를 수동으로 전송 하는 얇은 백 금 철사 또는 속눈썹로 만든 손 도구를 사용 하 여를 포함 한다. 이 방법은 정확한 하지만 기술 그리고 시간 요구 이며 동물의 많은 수를 포함 하는 연구에 대 한 제한. 또한 5 월을 따기 되며 물리적으로 손상 동물에 스트레스 잠재적으로 힘의 부 자연스럽 고 일관성 없는 금액에 개인을 쓰는 하 여. 세척 포함 버퍼 솔루션 문화 접시를 헹 구 고 새로운 문화 접시에는 동물 들과 함께 솔루션 유리 파스퇴르 피 펫을 통해 전송 됩니다. 이 방법은 신속 하 고 효율적인 하지만 여러 세대와 동물의 발달 단계는 대량에서 전송에 정확 하지 않다. FUDR, 같은 화학 치료는 차단 어떤 DNA 복제 그리고 이렇게, 생식 체 생산 및 계란 개발 통해 자손의 생산을 방지 하기 위해 자란 미디어에 녹아 수 있습니다. 동안 효과, 즉, 자사의 관리3이전 동물을 전송 하는 요구는 여전히 그리고 정상적인 발달 과정을 방해 하지로 발달 성숙 후이 메서드를 적용 해야 합니다. 이 메서드는 또한 여러 개의 셀룰러 신호 경로, 결과 동물에 눈에 띄는 효과 (예를 들어, 수명 연장 또는 변경 된 proteostasis) C. 선 충 사용5의 변형에 따라 영향 6,,78,,910. 교류 cytometry 방법을 자동으로 정렬 하 고 다른11한 멀티 잘 플레이트에서 개별 C. 선 충 을 전송. 이 방법은 매우 효과적이 고 효율적인 동안 흐름 cytometry 장비는 엄청나게 비싼 많은 연구원에 액세스할 수 있습니다. 동물을 전송 하는 대신 온도 등 그다지 15 fem-1, 온도 조정12살 균 되는 민감한 돌연변이 모델을 사용 하는 것입니다. 돌연변이 동물을 사용 하 여 하는 것이 어떤 상황에 유용 하지만 이러한 특정 변종 야생-타입 동물 보다 느리게 성장 하 고 그들은 에이징 또는 건강 한 벌레에 대 한 불 쌍 한 대표자로 봉사 하는 변경 된 게놈에 의존. 또한, 무 균을 유도 하기 위해 온도 변화에 대 한 의존도 또한 정적 환경의 부재에 발생 하 고 온도 변화 유전자 식13,14, 에 영향을 쉽게 표시 되었습니다 15. 연구 그룹 이전 크기16 C. 선 충 을 필터링 하는 메시의 사용을 설명 하는 기술을 출판. 그러나, 우리가 이전 작품 어떤 변화 같은 필터의 사용과 관련 된 전반적인 건강 결과에 대 한 테스트를 찾을 수 없었습니다.
따라서, 문화 판 사이의 동물의 많은 수를 전송 하기 위한 저렴 한 가격, 신속, 효율적이 고 정확한 방법에 대 한 C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 필요 하다. 향상 된, 액세스할 수 (라는 이름의 꼬마 체) 장비 및 그것의 제조 및 C. 선 충 연구 커뮤니티의 요구를 충족 하는 작업에 대 한 연결된 프로토콜의 조각을 개발 했습니다. 여기, 우리 꼬마 체 및 그 사용 방법의 디자인을 공유 하 고 우리는 그것의 사용 영향을 주지 않는 일반적인 건강 또는 표준 수동 채집 및 치료는 일반적으로 사용 되에 비교 될 때 어떤 스트레스 마커 입증 다 산 제한 화학 FUDR
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리 디자인 및 정렬 및 선 충 C.유지를 위한 도구로 서, 효과적인 꼬마 체의 사용을 소개 했다. 이 도구는 수동으로 개별 동물, 인구, 화학 치료 (예를 들어, FUDR), 그리고 더 비싼 방법 분리 동물의 세척을 따기 위해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 꼬마 체 효율적이 고 신속 하 게 (20 분 미만) 동물 (표 2)의 큰 혼합된 인구에서 자손을 정렬. 또한, 도구를 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그녀의 초기 공헌 연구 설계에 대 한 헤더 Currey 박사 Swarup Mitra 원고 그의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 마이클 B. 해리스 박사 의견, 개선,이 방법론의 시범 생산 지원을 감사 하 고 싶습니다. 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 간행물에서 보고 된 연구에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 UL1GM118991, TL4GM118992, 또는 RL5GM118990 국립 보건원의와 제도적 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 번호 5P20GM103395-15 국립 보건원의. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. UA는 AA/EO 고용주 및 교육 기관 및 개인에 대 한 불법 차별 금지: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
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