Caenorhabditis Сито: Низкотехнологичные инструмент и методологии для сортировки мелких многоклеточных организмов
Summary
Текущий протокол включает в себя методологию для сортировки и очистки соответствует возрасту населения Caenorhabditis elegans. Она использует простой, недорогой и эффективный инструмент по индивидуальному заказу для получения большой экспериментальной популяции нематод для научных исследований.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) является устоявшейся модельный организм, используется в различных основных и биомедицинских исследований. В пределах нематоды исследовательского сообщества существует необходимость для доступный и эффективный способ поддерживать большие, соответствует возрасту население C. elegans. Здесь мы представляем методологии для механически сортировки и очистки C. elegans. Наша цель-обеспечить экономически, эффективный, быстрый и простой процесс получения животных единообразных размеров и этапов жизни для их использования в экспериментах. Этот инструмент, Caenorhabditis сито, использует систему заказ крышкой, которая нити на общей трубы конической лаборатории и сортирует C. elegans на основе размера тела. Мы также продемонстрировать, что Caenorhabditis сито эффективно передает животных от одной культуры пластины другой позволяет для быстрой сортировки, синхронизация и очистки без влияния на маркеры здравоохранения, включая подвижность и стресс индуцибильный Джин репортеры. Это доступным и новаторский инструмент является быстрый, эффективный и не напряженный вариант для сохранения популяций C. elegans .
Introduction
Нематоды червей Caenorhabditis elegans, является премьер модельный организм. В дополнение к простой и управляемый характер их выращивания в лаборатории их весь геном последовательности1 и развития судьба каждой ячейки известен2. Благодаря этим свойствам C. elegans является широко используется модель организма для генетических исследований. Однако наряду с этими полезными характеристиками приходят некоторые проблемы для исследователей. Вследствие их быстрого поколения время C. elegans населения можно быстро запустить из пищи и/или стать смешанных популяций с нескольких поколений и этапы развития представит сразу. Таким образом эксперименты, проведенные на твердых нематоды роста СМИ (НГМ) требуют исследователи переехать физически животных свежие пластины до источника бактериального пищи истощает и новые личинки развиваются. Это может быть утомительно, как частые передачи животных требуется для предотвращения экспериментальной популяций от став смешивается с потомства поколений. Тем не менее некоторые эксперименты требуют как большое количество животных и длительное время точек (например, ДНК или РНК добыча в зрелом возрасте). Это усугубляет проблемы точно поддерживать синхронизированные населения и передачи большого количества животных.
Нынешние методы передачи C. elegans культивированный на NGM комплектации или мытья животных от плиты к плита; химически лечения животных (например, с fluorodeoxyuridine ингибитор репликации ДНК или FUDR); или с помощью проточной цитометрии для сортировки животных в нескольких хорошо пластины. Сбор включает в себя использование ручной инструмент, с тонкий провод платины или ресниц, внесенные вручную передачи отдельных или нескольких животных3,4. Этот метод является точной, но требует мастерства и времени и является ограничением для исследований с участием большого количества животных. Сбор мая также быть физически повреждения и напряженным для животных, потенциально подвергая лица неестественным и непоследовательных количество беспорядков и силы. Стиральная включает полоскания культуры блюдо с буферным раствором и передачи решения с животными через стеклянные пипетки Пастера новой культуры пластины. Этот метод является быстрым и эффективным, но не является точной, как несколько поколений и этапы развития животных передаются навалом. Химической обработки, такие как FUDR, может быть распущен в культивирования СМИ для предотвращения производства потомства через блокирование любых репликации ДНК и таким образом, развитие производства и яйцо гамет. В то же время эффективный, этот метод должен быть применен после развития созревания, чтобы не нарушить нормального развития процессов, и это означает, что все еще существует требование для передачи животных до его администрации3. Этот метод также влияет несколько сотовых сигнальные пути, что приводит к заметное воздействие на животных, как они возраста (например, продление срока службы или изменены proteostasis) в зависимости от штамма C. elegans используется5, 6,,78,9,10. Проточная цитометрия методы автоматически сортировать и передать еще11отдельных C. elegans от одной мульти хорошо пластины. Хотя этот метод является весьма эффективной и действенной, поток цитометрии оборудование чрезмерно дорогими и недоступными для многих исследователей. Альтернативой передачи животных является использование мутант моделей, которые температуры чувствительных, например Фер-15 и fem-1, которые становятся стерильные с регулировки температуры12. Хотя с помощью мутанта животных является полезным в некоторых ситуациях, эти конкретные штаммов растут медленнее, чем одичал тип животных, и они полагаются на изменения генома, выступающей в качестве бедных представителей для старения или здоровые черви. Кроме того, зависимость от температуры перехода побудить стерильности приводит также в отсутствие статической окружающей среды, и изменения температуры легко доказано влияние генов выражения13,14, 15. исследовательские группы опубликовали ранее методы, описывающие использование сетки для фильтрации C. elegans , размер16. Однако мы не смогли найти предыдущую работу, тестирование на любые изменения в общих результатов в отношении здоровья, которые могут быть связаны с использованием таких фильтров.
Таким образом, существует необходимость в C. elegans исследовательского сообщества для доступной, эффективного, быстрого и точного метода для передачи большого количества животных между пластинами культуры. Мы разработали улучшения, доступный кусок оборудования (название Caenorhabditis сито) и связанный протокол для его производства и эксплуатации, которая отвечает потребностям C. elegans научно-исследовательского сообщества. Здесь мы разделяем дизайн Caenorhabditis сито и методы для ее использования, и мы демонстрируем, что его использование не влияет на общее здоровье или любой стресс маркеры по сравнению с Стандартный ручной сбор и лечения с наиболее часто используемых ограничение рождаемости химических FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы ввели дизайн и использования доступных, эффективных Caenorhabditis сито как инструмент для сортировки и поддержание C. elegans. Этот инструмент имеет ряд преимуществ для вручную выбрать отдельных животных, Стиральная населения, химической обработки (например, FUDR) и более д?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Хизер Керрей ее первоначальный вклад дизайн исследования и доктор Сваруп Mitra для его критический обзор рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Майкл б. Харрис для комментариев, уточнений и помощь в подготовке демонстрации этой методологии. Штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis, который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Исследования в этой публикации было поддержано, национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под награду номера UL1GM118991, TL4GM118992 или RL5GM118990 и институционального развития Award (IDeA) от Национальный институт Генеральной медицинских наук национальных институтов здравоохранения грант номер 5P20GM103395-15. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. UA — AA/EO работодателя и учебное заведение и запрещает незаконной дискриминацию в отношении любого лица: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
Referências
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genética. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genética. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
