Caenorhabditis Sieve: En lågteknologiska Instrument och metod för sortering av små flercelliga organismer
Summary
Det nuvarande protokollet innehåller en metod för sortering och rengöring av åldersmatchade populationer av Caenorhabditis elegans. Det använder en enkel, billig, och effektivt skräddarsydda verktyg för att få en stor experimentell population av nematoder för forskning.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en väletablerad modellorganism används inom en rad grundläggande och biomedicinsk forskning. Inom nematoder forskarsamhället finns det ett behov av ett prisvärt och effektivt sätt att upprätthålla stora, åldersmatchade populationer av C. elegans. Här presenterar vi en metodik för mekaniskt sortering och rengöring C. elegans. Vårt mål är att tillhandahålla en kostnadseffektiv, effektiv, snabb och enkel process för att få djur av enhetliga storlekar och levnadsstadier för deras användning i experiment. Detta verktyg, Caenorhabditis sikten, använder en specialbyggda lock system som trådar på gemensamma koniska lab rör och sorterar C. elegans baserat på kroppsstorlek. Vi visar också att Caenorhabditis sikten effektivt överför djur från en kultur plattan till en annan vilket möjliggör en snabb sortering, synkronisera och rengöring utan att påverka markörer för hälsa, inklusive motilitet och stress-inducerbara gen reportrar. Tillgängliga och innovativa verktyget är en snabb, effektiv och icke-stressiga alternativet för att upprätthålla C. elegans populationer.
Introduction
Nematoder masken, Caenorhabditis elegans, är premier modellorganism. Förutom enkel och kontrollerad karaktären av deras odling i laboratoriet, deras hela genomet är sekvenserade1 och utvecklingsmässiga ödet för varje cell är känd2. På grund av dessa funktioner är C. elegans en allmänt använd modellorganism för genetiska studier. Dock kommer tillsammans med dessa välgörande egenskaper vissa utmaningar för forskare. På grund av deras snabba generationstid, C. elegans populationer kan snabbt slut på mat eller bli blandade populationer med flera generationer och utvecklingsstadier presentera på en gång. Således kräver experiment som utförs på solid nematoder tillväxt medier (NGM) forskare att fysiskt flytta djuren till färska plattor innan den bakteriella näringskälla utarmar och nya larver utvecklas. Detta kan vara långtråkig som en frekvent flyttande av djuren krävs för att förhindra de experimentella populationerna från att bli blandat med avkomma generationer. Fortfarande, några experiment kräver både stort antal djur och utökade tidpunkter (t.ex., DNA eller RNA extraktion i vuxen ålder). Detta föreningar noggrant upprätthålla en synkroniserad befolkning och överföra stora mängder djur utmaningar.
Nuvarande metoder för att överföra C. elegans odlade på NGM plockning eller tvätt djuren från platta till platta. kemiskt behandla djuren (e.g., med DNA-replikering hämmare fluorodeoxyuridine eller FUDR); eller med hjälp av flödescytometri för att sortera djuren i plattor med flera. Plockning innebär användning av ett verktyg, gjorda med antingen en tunn platina tråd eller en ögonfrans, kan du manuellt överföra enskilda eller flera djur3,4. Denna metod är korrekt men kräver både skicklighet och tid och är en begränsning för studier med stort antal djur. Plocka maj också vara fysiskt skadligt och stressande för djuren genom att potentiellt utsätta personer för onaturliga och inkonsekventa mängder störning och kraft. Tvätt innebär sköljning en kultur skålen med en buffertlösning och överföra lösningen med djuren via glas Pasteur-pipett till en ny kultur-platta. Denna metod är snabb och effektiv men är inte exakt som flera generationer och utvecklingsstadier av djur överförs i bulk. Kemiska behandlingar, såsom FUDR, kan upplösas i culturing media att förhindra produktion av avkomma genom blockerar någon DNA-replikation, och därmed, gamete produktion och ägg utveckling. Medan effektiva, denna metod måste tillämpas efter utvecklingsmässiga mognad att inte störa de normala utvecklingsprocesser, och detta innebär att det fortfarande finns ett krav på att överföra djuren före dess administration3. Den här metoden påverkar också flera cellulär signalering vägar, som leder till märkbara effekter på djuren när de blir äldre(t exen livslängd förlängning eller en förändrad proteostasis) beroende på stam av C. elegans används5, 6,7,8,9,10. Flödescytometri metoder automatiskt sortera och överföra enskilda C. elegans från en flera platta till en annan11. Även denna metod är mycket effektiv och ändamålsenlig, är flöde flödescytometri utrustning oöverkomligt dyra och otillgängliga för många forskare. Ett alternativ till överföra djur är att använda mutant modeller som är temperaturkänsliga, såsom fer-15 och fem-1, som blivit sterila med temperatur justering12. Med hjälp av muterade djur är användbart i vissa situationer, dessa särskilda stammar växa långsammare än vildtyp djur och de förlitar sig på en förändrad arvsmassa, tjänstgör som dålig företrädare för åldrande eller friska maskar. Dessutom förlitar sig på en temperatur Skift att inducera sterilitet resulterar också i avsaknad av en statisk miljö och temperaturförändringar har visats lätt att påverka gen uttryck13,14, 15. forskargrupper har tidigare publicerats tekniker som beskriver användningen av ett nät att filtrera C. elegans av storlek16. Dock kunde vi inte hitta tidigare arbete testning för eventuella ändringar i de övergripande hälsoresultat som kan förknippas med användning av sådana filter.
Således finns ett behov inom forskarsamhället C. elegans för en prisvärd, effektiv, snabb och noggrann metod för att överföra stora mängder djur mellan plattorna och kultur. Vi har utvecklat en förbättrad, tillgänglig utrustningsenhet (heter Caenorhabditis sikten) och ett tillhörande protokoll för dess tillverkning och drift som uppfyller behoven hos C. elegans forskarsamhället. Häri, vi dela utformningen av Caenorhabditis sikten och metoderna för dess användning, och vi visar att dess användning inte påverkar den gemensamma hälsan eller någon stress markörer jämfört med standard manuell plockning och en behandling med den vanliga, fertilitet-begränsa kemiska FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi introducerade häri, utformning och användning av den tillgängliga, effektiva Caenorhabditis sikten som ett verktyg för sortering och upprätthålla C. elegans. Detta verktyg har flera fördelar med att manuellt plocka enskilda djur, tvätta populationer, kemiska behandlingar (t.ex., FUDR) och dyrare metoder av segregerande djur. Först, den Caenorhabditis sikten effektivt och snabbt (mindre än 20 min) sorterar avkomma från stora blandade populationer av djur (tabell 2<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Heather Currey för hennes första bidrag till studiedesign och Dr Swarup Mitra för hans kritiska granskning av manuskriptet. Vi vill också tacka Dr Michael B. Harris för kommentarer, finesser och hjälp producera demonstration av denna metod. Stammarna tillhandahölls av stadens Caenorhabditis genetik, som är finansierad av NIH kontor infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Den forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute Of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health Award nummer UL1GM118991, TL4GM118992 eller RL5GM118990 och av en institutionell utveckling Award (IDeA) från Nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper av det nationella Institutes of Health under grant number 5P20GM103395-15. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health. UA är AA/EO arbetsgivare och läroanstalt och förbjuder olaglig diskriminering mot någon individ: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
Referências
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genética. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genética. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
