Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom <em>Cyclotella Meneghiniana</em> in Liposomes with Thylakoid Lipids

Kerstin Pieper; Kathi Gundermann; Lars Dietzel

doi:10.3791/58017

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Изоляция и включения светособирающего антенны от диатомовые водоросли Cyclotella Meneghiniana в липосомах с липидами тилакоидов

Published: August 28, 2018

doi:

10.3791/58017

Kerstin Pieper, Kathi Gundermann, Lars Dietzel

¹Institute for Molecular Biosciences,Goethe University

Summary

Здесь мы представляем протокол изолировать фукоксантин хлорофилл кондиционера связывания белков (FCP) диатомовых водорослей и включить их в липосомы с естественным липидной композиции для изучения передачи энергии возбуждения после изменения ионного состава.

Abstract

Фотосинтетическая производительности растений, водорослей и диатомовые водоросли сильно зависит от быстрого и эффективного регулирования света уборки и энергии процессов переноса в тилакоидной мембране хлоропластов. Свет, уборки антенна диатомовых водорослей, так называемые фукоксантин хлорофилл кондиционера связывая протеинов (FCP), необходимые для поглощения света и эффективную передачу реакционном центров также для фото защита от чрезмерного света. Переключение между этими двумя функциями является давней проблемы исследования. Многие из этих исследований были проведены с FCP в мицеллах моющего средства. Для исследования взаимодействия были удалены моющих средств, что привело к неспецифическим агрегации FCP комплексов. В этом подходе трудно различать артефакты и физиологически соответствующих данных. Таким образом можно получить более ценную информацию о FCP и другие мембраны связаны света уборки комплексов путем изучения взаимодействий протеин протеина, передачи энергии и другие спектральные особенности, если они встроены в их среде родной липидов. Главным преимуществом является, что липосомы имеют определенный размер и соотношение определенных липидов/белков, в которой контролируется степень FCP кластеризации. Кроме того изменения в составе рН и Иона, которые регулируют света уборки в естественных условиях легко могут быть смоделированы. По сравнению с тилакоидной мембраны липосомы более однородной и менее сложным, что делает его легче получить и понять спектральные данные. Протокол описывает процедуру FCP изоляции и очистки, липосомы подготовки и включения FCP в липосомы с естественный липидный состав. Результаты от типичного приложения дают и обсуждены.

Introduction

Фотосинтетических организмов, таких как диатомовые водоросли должны справиться с постоянно меняющейся освещенности и реагировать с адаптационного сложные механизмы, которые поддерживать высокую эффективность фотосинтеза и защищать от фото окислительных повреждений, вызванных чрезмерным свет. Основной свет защитные процесс в фотосинтетические eukaryotes является высокой энергии закалочные (q_E) поглощается света, который возникает как главный вклад не фотохимического тушения (ЕНОЛ) под легкий стресс условия¹^,² ^,³. Света уборки антенные комплексы (LHC) участвуют в регуляции пути передачи энергии возбуждения. В ответ на высокий свет индуцированной низкий рН в просвете хлоропластов, Антенные переключатели системы от света уборки тушения состояние. Этой энергии диссипативных государство защищает фотосистемы (PS) и других комплексов в тилакоидной мембране от фото окисления. В фотосинтетической эукариот q_E индуцируется обычно двух факторов¹^,²^,³. Одним из факторов является специализированным свет уборки белок, который реагирует с низким рН. ОВО белка индуцирует д_Е в высших растений⁴. LhcSRs⁵, модулированные деятельности ОВО, побудить д_Ев зеленых водорослей⁶. Диатомовые водоросли обладают Lhcx подобных белков, структурно связанные с LHCSRs⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰.

Второй фактор q_E является цикл Ксантофилл где преобразован в форму фото защитные деэпоксидации и вернулась эпоксидирования каротиноиды антенны. В растениях и зеленые водоросли виолаксантина преобразуется в зеаксантин. В диатомовых водорослей diadinoxanthin преобразуется в diatoxanthin, который затем коррелирует с степень ЕНОЛ¹¹. Диатомовые водоросли света уборки антенна обладает некоторые особенности, хотя это эволюционный, относящиеся к заводе и водорослей LHCs. Переход от света, заготовки для фото защиты чрезвычайно быстрый и ЕНОЛ способности выше по сравнению с растений¹². Это может быть одной из причин, почему диатомеи очень успешно в различных экологических ниш в пути, что они отвечают за до 45% океанических чистой первичной продукции¹³. Таким образом диатомовые водоросли света уборки систем являются интересным объектом исследований фотосинтеза.

Диатомовые водоросли, как ориентированных видов Cyclotella meneghiniana, обладают тилакоидов внутренние свет заготовки систем, названный пигменты они связывают – фукоксантин, хлорофилла (ХЛ) a и c, поэтому FCP. света уборки белков, например FCPs, являются Встроенный в системе мембрана тилакоида состоит из нескольких слоев мембраны. Диатомовые водоросли образуют полосы три тилакоидов. Этот комплекс положение делает его трудным для их изучения на молекулярном уровне в тилакоидной мембраны. Кроме того многие компоненты способствуют регуляции света уборки (см. выше). Таким образом во многих подходов, комплексы были изолированы от мембраны, используя мягкий моющих средств, таких как н додецил β-D-maltopyranoside (β-DDM), который солюбилизировать последнего мембраны, но сохраняют FCP комплексов. Многие спектроскопические исследования были проведены с использованием растворимых FCP расследовать внутримолекулярной энергии передачи¹⁴^,^,¹⁵¹⁶^,¹⁷. Однако этот бывший подход был ограничен, поскольку регулирование передачи энергии экситонных взаимодействие с другими антенные комплексы или фотосистемы. Следовательно, эти виды исследований не могут осуществляться с растворимых комплексов потому, что взаимодействие между комплексами теряется.

Важной особенностью в положении антенна является «молекулярная вытеснения» антенны и фотосистем в тилакоидной мембраны¹⁸. Ранее, простой подход было проведено, чтобы имитировать этот эффект в пробирке. Был удален моющих средств, что приводит к случайным агрегации антенных комплексов. Хотя некоторые разумные данных было получено¹⁷^,этот подход¹⁹, моющего средства удаления не отражает ситуацию в естественных условиях и имеет некоторые ограничения, поскольку комплексы не взаимодействующих в их регулярных третичный структура.

Использование липосомы преодолевает несколько бывших ограничений. Третичная структура по-прежнему полностью нетронутыми. Липосомы мембраны обеспечивает квази родной среде для антенных комплексов. Мембрана отделяет внутри липосом из внешней среды. Этими средствами липосомы предоставляют две реакции отсеков для исследований Ион и pH градиентов, а также транспортных процессов. Кроме того параметры экспериментальной системы могут контролироваться более легко исследований в тилакоидной мембраны. Уже показано, что липосомы были отличным инструментом для изучения фотосинтетической комплексов. Основное внимание в прошлом был на заводе LHC, где влияние изменения липидного состава был протестирован на LHC II²⁰. В других подходов протеин протеина взаимодействия между различными LHC II были исследованы²¹. Кроме того, некоторые в зеленых водорослей были проведены исследования описывают, спонтанное кластеризации между LHC²². Учитывая важность диатомовых водорослей для водных экосистем относительно немногие исследования проводились с антенные комплексы диатомовых водорослей. Два исследования исследованы антенные комплексы ориентированных Cyclotella meneghiniana, где были показаны кластеризации FCP антенна²³ и оперативности FCP электрохимических градиентов²⁴ . Таким образом липосомы являются отличным инструментом для изучения взаимодействия диатомовых антенн и их регулирования в условиях почти родной. Липосомы универсальны, поскольку многие условия, такие как липидного состава, липосомы размер, плотность белка и окружающей водной фазе может контролироваться. Кроме того этот метод требует низкого количества образцов. Экспериментальная система является надежной и высокую воспроизводимость. Изолированность липосомы позволяет для изучения рН и Ион градиенты, которые являются важными факторами в регулировании антенных комплексов.

Здесь мы описываем изоляции FCP антенных комплексов с C. meneghiniana и их включения в липосомах с естественным тилакоидов липидный состав. Кроме того мы предоставляем образцовые данные для спектральные характеристики растворимых FCP и сравнить их с FCP в липосомах. Метод обобщает знания и стандартизованных протоколов, полученные от улучшения Гундерманн и бушель 2012²³, Натали et al. 2016²²и²⁴Ахмад и Дицеля 2017.

Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса. (1) относится к пункту 1, который описывает рост клеток, нарушения и изоляции тилакоид с following FCP разделения на градиенты плотности сахарозы; C. м. –Cyclotella meneghiniana клетки. (2) приготовления смеси натуральных тилакоидов липидов (MGDG, DGDG и SQDG) описано в пункте 2 и создание мицелл липидов-моющего средства с octylglycoside (ОГ). Размер определенный липид мицеллы достигается методом экструзии, с использованием определенной поры диаметром мембраны. FCP и липидов мицеллы унифицированы на предопределенные липидов: соотношение белка и моющих средств, ОГ и β-DDM будут удалены через контролируемые диализа, образуя FCP proteoliposomes. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Примечание: Фотосинтетическая комплексы такие как FCPs весьма уязвимы для тепла и света. Всегда работайте на льду и очень тусклый свет. 1. изоляция FCP от клеток Тилакоидов изоляции от клеток C. meneghiniana Растут C. meneghiniana в пяти 500 мл колб, кот…

Representative Results

Протокол описывает изоляции всего FCP фракции от Cyclotella meneghiniana и включения в липосомы с родной липидный состав. Изоляция тилакоидов высокую воспроизводимость, но тилакоидов доходность может измениться. Результатом является приемлемым, если более 50% всех пигментов …

Discussion

FCP липосомы с естественный липидный состав обеспечивают удобный, простой и воспроизводимые инструмент исследовать спектральные свойства в пробирке. Окружающей среды липидов в FCP липосомы напоминает ситуацию в тилакоидной мембраны, рождая экспериментальные результаты, которые н?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим рана Adeel Ахмад за помощь в FCP очистки. Профессор Claudia Büchel признается за полезные обсуждения и читать рукопись. Эта работа была поддержана Немецкий исследовательский фонд, чтобы LD (DI1956-1/1) и Фонд Гумбольдта Феодор Линен стипендий на LD.

Materials

500 ml centrifuge vials
high speed centrifuge	Heraeus
Bead Mill VI 2	Edmund-Bühler (edmund-buehler.de)		newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6
Silibeads S 400 µm	Sigmund-Lindner.com	5223-7
Silibeads S 1,-1,3 mm	Sigmund-Lindner.com	4504
VitraPOR filter funnel – por1	ROBU GmbH	21121
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	314348
Ultracentrifuge Discovery 90SE	Sorvall	n.a.
rotor T 865	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	51411
Neubauer Cell Counter Chamber (improved)	Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)	T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7)	Optik-Pro (optik-pro.de)	51428
optical glass cuvettes (6040-OG)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	"6040-10-10"
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)	Jasco (jasco.de)	V-630
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	D310LA
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	344061
rotor AH629-17-mL	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	54285
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff	Millipore (merckmillipore.com)	4307
Biometra Minigel-Twin	Analytik Jena AG (analytik-jena.de)	846-010-100
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad (bio-rad.com)	1610449
libre office spread sheet	The document foundation	https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	101-10-20
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)	Jasco (jasco.de)	FP-6500
SDS-loading buffer Roti-Load	ROTH (carlroth.com)	K929.1
n-octyl β-D-glucopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	O311
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1300	make stock solution in chloroform
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1310	make stock solution in chloroform
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1230	make stock solution in chloroform
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)	Larodan AB (larodan.com)	37-0150	make stock solution in chloroform
L-α-Phosphatidylcholine	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	P3782 SIGMA	make stock solution in chloroform
sonicator bath S-50TH	Sonicor (getmedonline.com	SONICOR-S-50TH
mini-Extruder	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610000
Nuleopore polycarbonate membrane	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610005
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff	ROTH (carlroth.com)	0653.1	boil in destilled water before use
Biobeads SM2 Adsorbent	Biorad (Bio-rad.com)	152-3920
sucrose epichlorhydrin copolymer – Ficoll 400	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	F4375
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	252150
rotor TFT 80.4	Millipore (merckmillipore.com)	54356
*material listed in order of appearance*
For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.
Standard lab material and substances are not listed.

Referências

Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -. L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Bioquímica. 40 (42), 12552-12561 (2001).
Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Bioquímica. 45 (43), 13046-13053 (2006).
Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Bioquímica. 42 (44), 13027-13034 (2003).
Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Pieper, K., Gundermann, K., Dietzel, L. Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids. J. Vis. Exp. (138), e58017, doi:10.3791/58017 (2018).