Användning av musen Splenocytes att bedöma patogen-associerade molekylära mönster inflytande på klocka genuttryck
Summary
Det här protokollet beskriver en teknik som använder musen splenocytes för att upptäcka patogen-associerade molekylära mönster som förändrar molekylära klockan genuttryck.
Abstract
Från beteende till genuttryck reglera dygnsrytmen nästan alla aspekter av fysiologi. Här presenterar vi en metod för att utmana mus splenocytes med patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) lipopolysackarid (LPS), ODN1826 och värmeavdödade Listeria monocytogenes och bedöma deras inverkan på molekylära dygnsrytm klockan. Tidigare har studier fokuserat på att undersöka påverkan av LPS på molekylära klockan med hjälp av en mängd in-vivo och ex vivo metoder från ett sortiment av modeller (t.ex. mus, råtta och mänskliga). Det här protokollet beskriver isolering och utmaningen att splenocytes, liksom metoden att bedöma gen uttryck efter utmaningen klocka via kvantitativ PCR. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bedöma inte bara påverkan av mikrobiella komponenter på den molekylära klockan men andra molekyler såväl som kan förändra uttrycket av klockan. Detta synsätt skulle kunna utnyttjas för att retas isär den molekylära mekanismen för hur PAMP-Toll-like receptor interaktionen påverkar klocka uttryck.
Introduction
Masterklockan hos däggdjur som orkestrerar 24 h svängningar för nästan alla aspekter av fysiologi och beteende, är beläget inom suprachiasmatiska kärnan (SCN) av hypotalamus1,2. Förutom att reglera biologiska processer på organismers nivå, synkroniserar masterklockan även perifera cellulära klockor i hela kroppen3,4,5. Medan den molekylära klockan maskinen består av minst tre samverkande transkriptionell-translationell återkopplingar, består kärnan av Period (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, och klockan gener6,7. Förutom att upprätthålla perfekt timing av core molekylära klockan, vissa accessoriska klocka genprodukter (t.ex. Rev-erbα och Dbp) reglerar också icke-klocka genuttryck, klockan dvs kontrollerade gener (CCGs)6 , 7.
Funktionella molekylära klockor har beskrivits i olika immun vävnader (t.ex., mjälten och lymfkörtlarna)8 och celler (t.ex., B-celler, dendritiska celler, makrofager)8,9. Dessa celler upptäcka och svara på patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), bevarade mikrobiella komponenter, via medfödd immun erkännande receptorer såsom Toll-liknande receptorer (TLR)10. Hittills har har 13 funktionella TLRs beskrivits, som känner igen mikrobiella beståndsdelar såsom bakteriella cellväggen komponenter, flagellar protein och mikrobiell nukleinsyra10. PAMP, lipopolysackarid (LPS), beståndsdel cellväggen i gramnegativa bakterier igen av TLR4, har visat sig förändra dygnsrytmen på både organismer och molekylär nivå. Exempelvis i vivo utmaning av LPS inducerad photic-liknande fas förseningar mätt som aktivitet i möss11 och ledde till minskad klocka genuttryck i SCN och lever enligt fastställt i situ hybridisering och kvantitativ PCR, respektive i råttor12. Efter en i vivo utmaning med LPS avslöjade analys av människans perifera leukocyter13 och subkutan fettvävnad14 förändrat uttryck av flera klocka gener mätt via qPCR. Slutligen, ex vivo LPS utmaningar av mänskliga makrofager och mus peritoneal makrofager, ledde också till förändrad klocka uttryck mätt med qPCR14.
Här beskriver vi ett protokoll för att bedöma påverkan av PAMPs LPS, ODN1826 (syntetiska oligonukleotider som innehåller unmethylated CpG motiv), och värmeavdödade Listeria monocytogenes (HKLM), erkänd av TLR4, TLR9 och TLR2, respektive, på molekylära klockan genuttryck i mus splenocytes. Protokollet innehåller mus splenektomi, splenocyte isolering och utmaning, RNA extraktion, cDNA syntes och qPCR för att bedöma flera klocka genuttryck. Detta protokoll tillåter lägligt förvärvet av ett stort antal immunceller med mycket lite djur eller cellulära manipulation, som sedan kan utmanas ex vivo med olika PAMPs. Den molekylära klockan har visat att modulera olika aspekter av immunsvar8,15,16, därför störningar av molekylära klockan sannolikt skulle försämra korrekt tidsberoende variationen av den immunsvar. Dessutom, eftersom störningar av dygnsrytmen kan leda till allvarliga patologier17,18,19,20, kan det vara av intresse för forskare att utmana splenocytes med ett brett utbud av molekyler och bedöma deras inflytande på klockan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inom detta protokoll, kan en microvolume spektrofotometer användas för att kvantifiera och utvärdera renheten av RNA som används vid fastställandet av genuttryck. Nukleinsyror absorbera UV-ljus på 260 nm, proteiner normalt absorberar ljus vid 280 nm, medan andra potentiella föroreningar som används under en RNA extraktionsmetod (exempelvis fenol) är detekterbara 230 nm. Därför, genom att bedöma absorbans (A) baserat på 260/280 nm (RNA till protein) och 260/230 nm (RNA till icke-protein föroreningar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av fakulteten forskningsanslag från de College of Arts och vetenskaper rektorns kontor på universitet i Hartford.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
Referências
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
