लिविंग Xenopus Tadpoles में घ्राण मार्ग का कार्यात्मक मूल्यांकन
Summary
Xenopus tadpoles vivo में नर्वस सिस् टम के फंक्शन की जांच के लिए एक अनोखा प् लेटफॉर्म पेश करते हैं । हम सामान्य पालन स्थितियों में या चोट के बाद रहने वाले Xenopus लार्वा में घ्राण जानकारी के प्रसंस्करण का मूल्यांकन करने के तरीके का वर्णन करते हैं ।
Abstract
Xenopus tadpoles तंत्रिका तंत्र के समारोह की जांच करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करते हैं । वे कई इमेजिंग दृष्टिकोण, electrophysiological तकनीक और व्यवहार परख के लिए पहुंच के रूप में कई प्रयोगात्मक लाभ, प्रदान करते हैं । Xenopus टैडपोल घ्राण प्रणाली विशेष रूप से अच्छी तरह से सामांय विकास के दौरान स्थापित synapses के समारोह की जांच या चोट के बाद सुधार के लिए अनुकूल है । यहां, हम Xenopus लार्वा रहने में घ्राण जानकारी के प्रसंस्करण का मूल्यांकन करने के तरीके का वर्णन करते हैं । हम घ्राण के साथ घ्राण बल्ब के glomeruli में presynaptic कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के vivo माप में का एक संयोजन रूपरेखा-निर्देशित व्यवहार परख । तरीकों घ्राण नसों के transection के साथ synaptic कनेक्टिविटी के rewiring का अध्ययन करने के लिए जोड़ा जा सकता है । प्रयोगों दोनों जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र कोशिकाओं में GFP पत्रकारों को व्यक्त पशुओं का उपयोग कर प्रस्तुत कर रहे हैं । आनुवंशिक रूप से संशोधित tadpoles के लिए वर्णित दृष्टिकोण के आवेदन आणविक आधार है कि हड्डीवाला व्यवहार को परिभाषित करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
Introduction
Xenopus tadpoles तंत्रिका तंत्र के सामांय समारोह का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट पशु मॉडल का गठन । पारदर्शिता, एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम1,2, और शल्य चिकित्सा के लिए पहुंच, electrophysiological और इमेजिंग तकनीक Xenopus लार्वा के अद्वितीय गुण है कि vivo 3 में ंयूरॉन कार्यों की जांच की अनुमति . इस पशु मॉडल की कई प्रयोगात्मक संभावनाओं में से कुछ टैडपोल संवेदी और मोटर सिस्टम4,5,6पर प्रदर्शन पूरी तरह से अध्ययन से सचित्र हैं । synapses के स्तर पर सूचना संसाधन के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल न्यूरॉन सर्किट Xenopus टैडपोल घ्राण प्रणाली7है. सबसे पहले, अपनी synaptic कनेक्टिविटी अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है: घ्राण बल्ब के लिए घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) परियोजना और synaptic के dendrites के साथ mitral संपर्क स्थापित/glomeruli के भीतर के लिए गंध नक्शे उत्पन्न दूसरे, इसके ORNs लगातार8घ्राण रास्ते की कार्यक्षमता बनाए रखने के लिए जीवन भर neurogenesis द्वारा उत्पंन कर रहे हैं । और तीसरे, क्योंकि घ्राण प्रणाली एक महान अपक्षयी क्षमता से पता चलता है, Xenopus tadpoles9पृथक के बाद अपने घ्राण बल्ब पूरी तरह से सुधार करने में सक्षम हैं ।
इस पत्र में, हम दृष्टिकोण है कि व्यवहार प्रयोगों के साथ tadpoles रहने में घ्राण glomeruli के इमेजिंग गठबंधन का वर्णन करने के लिए घ्राण रास्ते की कार्यक्षमता का अध्ययन । यहां विस्तृत तरीकों घ्राण तंत्रिका transection10के बाद घ्राण बल्ब में glomerular कनेक्टिविटी के कार्यात्मक वसूली अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । Xenopus tadpoles में प्राप्त डेटा रीढ़ के प्रतिनिधि के बाद से घ्राण प्रसंस्करण है विकासवादी संरक्षित है ।
वर्णित विधियाँ x. tropicalis का उपयोग कर उदाहरण हैं, लेकिन वे आसानी से xमें कार्यान्वित किया जा सकता है । laevis। वयस्क एक्स laevisके बड़े आकार के बावजूद, दोनों प्रजातियों टैडपोल चरणों के दौरान उल्लेखनीय समान हैं । मुख्य अंतर जीनोमिक स्तर पर रहते हैं । X. laevis ज्यादातर अपने allotetraploid जीनोम और लंबी पीढ़ी के समय (लगभग 1 वर्ष) द्वारा निर्धारित गरीब आनुवंशिक पथ, प्रदर्शित करता है । इसके विपरीत, एक्स tropicalis अधिक आनुवंशिक अपनी छोटी पीढ़ी के समय (5-8 महीने) और द्विगुणित जीनोम के कारण संशोधनों के लिए उत्तरदाई है । प्रतिनिधि प्रयोग जंगली प्रकार के जानवरों और तीन अलग ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए सचित्र हैं: Hb9: GFP (x. tropicalis), एनबीटी: GFP (एक्स.tropicalis) और tubb2: GFP (एक्स. laevis) ।
मौजूदा काम में उल्लिखित के तरीके आनुवंशिक Xenopus क्षेत्र में प्रगति के साथ विचार किया जाना चाहिए । सादगी और प्रस्तुत तकनीक के आसान कार्यांवयन उंहें पहले से ही वर्णित मूल्यांकन के लिए विशेष रूप से उपयोगी बनाता है11म्यूटेंट, साथ ही साथ Xenopus CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी12द्वारा उत्पंन लाइनें । हम भी एक शल्य घ्राण नसों कि किसी भी Xenopus tadpoles के लिए उपयोग कर प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है transect के लिए इस्तेमाल की प्रक्रिया का वर्णन । presynaptic कैल्शियम प्रतिक्रियाओं और घ्राण निर्देशित व्यवहार के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण विशिष्ट उपकरण की आवश्यकता है, हालांकि एक उदारवादी कीमत पर उपलब्ध है । के तरीके एक साधारण रूप में प्रस्तुत कर रहे है अनुसंधान समूहों में उनके उपयोग को बढ़ावा देने और अधिक जटिल परख के आधार या तो सुधार लागू करने या अंय तकनीकों, यानी, ऊतकवैज्ञानिक या आनुवंशिक दृष्टिकोण से संघ द्वारा निर्धारित सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह कागज तकनीकों कि रहने वाले Xenopus tadpoles में घ्राण रास्ते की कार्यक्षमता की जांच करने के लिए उपयोगी है वर्णन करता है । वर्तमान प्रोटोकॉल उन प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो काम करते हैं, या X…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; SAF2015-63568-R) द्वारा cofunded यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि (ERDF), एम. जी. एफ. Fuortes मेमोरियल फैलोशिप, स्टीफन डब्ल्यू Kuffler फैलोशिप कोष, लौरा और आर्थर Colwin संपंन ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप कोष से प्रतिस्पर्धी अनुसंधान पुरस्कार द्वारा , Fischbach फैलोशिप, और समुद्री जैविक प्रयोगशाला और राष्ट्रीय Xenopus संसाधन RRID के महान पीढ़ी निधि: SCR_013731 (वुड्स होल, MA) जहां इस काम के एक हिस्से का आयोजन किया गया था । हम भी CERCA कार्यक्रम/Generalitat de Catalunya संस्थागत सहायता के लिए धंयवाद । अल एक सेरा Húnter येता.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
Referências
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neurociência. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Biologia do Desenvolvimento. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologia do Desenvolvimento. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. . Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
