Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines
Summary
Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.
Abstract
Une barrière à la compréhension de comment les divers types de cellules et signaux contribuent au fonctionnement synaptique est le manque de modèles pertinents pour l’étude du cerveau humain. Une technologie émergente pour régler ce problème est l’utilisation de trois dimensions (3D) cellules neurales cultures, appelé « organoids » ou « sphéroïdes », pour la préservation à long terme des interactions intercellulaires, y compris les molécules d’adhérence extracellulaire. Toutefois, ces systèmes de culture sont longues et pas systématiquement généré. Ici, nous détaillons une méthode pour produire rapidement et uniformément des cocultures 3D des neurones et les astrocytes de pluripotentes humaines de cellules souches. Tout d’abord, différenciées des astrocytes et des progéniteurs neurones sont dissociées et comptés. Ensuite, les cellules sont combinées dans la sphère formant des plats avec un inhibiteur de la Rho-Kinase et à des rapports spécifiques pour produire des sphères de taille reproductible. Après plusieurs semaines de culture comme des sphères flottantes, cocultures (« astéroïdes ») sont finalement sectionnés pour immunostaining ou plaquées sur baies multiélectrodes pour mesurer la force et la densité synaptique. En général, il est prévu que ce protocole donnera 3D sphères neurones qui affichent des marqueurs de type cellule mature restreint, forment des synapses fonctionnelles et montrent une activité éclatement spontané réseau synaptique. Ensemble, ce système permet de dépistage des drogues et des enquêtes sur les mécanismes de la maladie dans un modèle plus approprié par rapport à des cultures monocouches.
Introduction
Avec une variété de responsabilités fonctionnelles au-delà de soutien structurel, les astrocytes sont un type de cellules gliales très abondante dans le système nerveux central (CNS). Par le biais de la sécrétion de facteurs solubles synaptogenic et constituants de la matrice extracellulaire (ECM), astrocytes aident à la mise en place et le regroupement des synapses matures au cours du développement1. Ils jouent un rôle essentiel dans le maintien de la santé et la plasticité des synapses à extracellulaire signalisation2,3,4,5aussi et contribuent à la stabilité à long terme de l’homéostasie environnements en régulant le potassium extracellulaire et glutamate, ainsi que la sécrétion de substrats énergétiques et ATP6,7,8. Enfin, ils peuvent contribuer à la neurotransmission en influant sur les courants extrasynaptic9et peuvent influencer indirectement l’activité à travers d’autres types de cellules, telles que la promotion de la myélinisation10. Ce qui est important, car l’anomalie ou dysfonctionnement des astrocytes peut conduire à de nombreux syndromes neurodéveloppementaux et neuropathologie adulte, il y a un besoin évident d’inclure aux côtés de neurones dans l’ingénierie réseaux de neurones, les astrocytes dans l’ordre pour une meilleure modèle de l’environnement de cerveau endogène. Une caractéristique intégrale des astrocytes est leur capacité à forme dynamique des interactions avec les synapses neuronales1,11,12. En l’absence des cellules gliales, les neurones forment un nombre limité de synapses, ce qui en général aussi le manque de maturité fonctionnelle13.
Astrocytes humains présentent des caractéristiques morphologiques, transcriptionnelles et fonctionnels, tels que l’augmentation de la taille et la complexité du branchements, ainsi que des gènes — qui ne sont pas récapitulée dans rongeurs12,14, 15. Ainsi, des études utilisant les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-des cellules neuronales dérivées sont largement acceptés comme un moyen d’examiner les maladies liées à la CNS in vitro tout en développant de nouveaux traitements, modèles de lésion et paradigmes de la culture16 ,,17. En outre, hPSCs permettre l’étude de la formation des synapses humaines et de la fonction sans la nécessité pour le tissu principal18,19.
Une barrière à la compréhension de comment les divers types de cellules et signaux contribuent au fonctionnement synaptique est le manque de modèles appropriés du cerveau humain. Il y a un besoin pour une plate-forme appropriée récapituler ses réseaux synaptiques avec haute fidélité et de la reproductibilité. Récemment, l’intérêt a émergé dans la production de systèmes de culture 3D (généralement connu comme « organoids », « sphéroïdes », ou « mini cerveaux »)20 pour modéliser le complexe en trois dimensions (3D) structures au niveau cellulaire et macro. Systèmes de culture 3D conservent des interactions ECM et les cellules qui sont normalement absents ou limités au cours de la co-culture 2D typique paradigmes21,22. Une abondance de techniques existent pour la culture des sphéroïdes neurale 3D23,24,25; Cependant, beaucoup exigent des périodes de culture longue (mois à années) pour le développement spontané et préservation de la couche, avec l’utilisateur présentant très peu de contrôle sur la sortie.
Ici, nous illustrons une méthode systématique pour rapidement et constamment des interactions neuronales bioingénieur parmi plusieurs types de cellules (différenciée des neurones et les astrocytes) dérivé de hPSCs en assemblant des cellules dans les cocultures sphère (« astéroïdes »)26 qui récapitulent les complexités morphologiques spécifiques à l’humain en 3D. Ce système neural haute densité génère des sous-types neurales-répartie qui prennent matures propriétés au fil du temps et peuvent être projetés ou dosés de manière à haut débit. Nous montrons pour la première fois que les astrocytes humains induisent réseau synaptique rafale activité dans ces cocultures 3D. En outre, le présent protocole est facilement adaptable pour générer des sphères de différentes tailles, d’utiliser des cellules spécifiées à différentes identités régionales du SNC et pour étudier les interactions de plusieurs autres types de cellules comme vous le souhaitez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode systématique pour la production des sphères 3D des cocultures neuronales. Les sphères sont composées des astrocytes et les neurones, qui sont dérivées de manière indépendante de hPSCs. Bien que pas l’objectif du présent protocole, la génération des populations pures des astrocytes du hPSCs28 est une étape cruciale et peut être techniquement difficile si effectuée sans expérience préalable. Cette première étape de la génération d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Dr. Erik Ullian (UCSF) pour un apport intellectuel sur la conception de ces procédures, Dr Michael Ward (NIH) pour des conseils techniques sur la différenciation des rudolfinho et Saba Barlas d’analyse d’images préliminaires.
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
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