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Biologia do Desenvolvimento

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

In diesem Protokoll wollen wir beschreiben eine reproduzierbare Methode für Kombination dissoziiert menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet Neuronen und Astrozyten gemeinsam in 3D Kugel Kokulturen, pflegen diese Kugeln in den frei schwimmenden Bedingungen und anschließend Messung der synaptischen Schaltung Aktivität der Kugeln mit Immunoanalysis und multielectrode Array-Aufnahmen.

Abstract

Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen für das Studium des menschlichen Gehirns. Eine neue Technologie zur Behebung dieses Problems ist die Verwendung von drei dreidimensionale (3D) neuronalen Zellkulturen, “Organellen” oder “Sphäroide”, für die dauerhafte Erhaltung der interzelluläre Wechselwirkungen einschließlich extrazellulärer Adhäsionsmoleküle bezeichnet. Diese Systeme sind jedoch zeitaufwendig und nicht systematisch erzeugt. Hier wir ausführlich eine Methode, um schnell und konsequent produzieren 3D Kokulturen von Neuronen und Astrozyten aus menschlicher pluripotenter Stammzellen. Erste, bereits differenzierte Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen sind getrennt gezählt. Als nächstes werden Zellen im Bereich Bildung kombiniert Gerichte mit einem Rho-Kinase-Inhibitor und in bestimmten Verhältnissen Sphären reproduzierbare Größe produzieren. Nach mehreren Wochen der Kultur als schwimmende Kugeln sind Kokulturen (“Asteroiden”) schließlich für Immunostaining geschnitten oder überzogen auf multielectrode Arrays, synaptische Dichte und Stärke zu messen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass dieses Protokoll neuronale 3D-Kugeln, die anzeigen Reife Zelltyp eingeschränkt Marker erzielt werden, funktionale Synapsen bilden und zeigen spontane synaptischen Netzwerkaktivität platzen. Dieses System ermöglicht zusammen, Drogen-Screening und Untersuchungen zu Mechanismen der Krankheit in einem geeigneteren Modell im Vergleich zu Monolayer-Kulturen.

Introduction

Astrozyten sind ein sehr reichlich glialen Zelltyp innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) mit einer Vielzahl von funktionalen Aufgaben über strukturelle Unterstützung. Astrozyten Beihilfen durch Sekretion von löslichen Synaptogenic Faktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) bei der Schaffung und Bündelung von Reifen Synapsen während Entwicklung1. Sie auch spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit und der Plastizität der Synapsen durch extrazelluläre Signal2,3,4,5, und tragen zur langfristigen Stabilität der homöostatischen Umgebungen durch Regulierung der extrazellulären Kalium sowie Glutamat und die Sekretion von Energie-Substrate und ATP6,7,8. Endlich, sie können dazu beitragen, Neurotransmission durch Beeinflussung der extrasynaptic Ströme9, und Aktivität durch andere Zelltypen wie die Förderung der Myelinisierung10indirekt beeinflussen können. Wichtig ist, weil zu viele Neurodevelopmental Syndrome und Erwachsenen Neuropathologie Anomalie oder Dysfunktion der Astrozyten führen kann, gibt es offensichtlich notwendig, damit eine verbesserte Astrozyten neben Neuronen innerhalb veränderter neuronaler Netze enthalten Modell der endogenen Gehirn Umwelt. Ein integraler Bestandteil Astrozyten ist ihre Fähigkeit, Form dynamischer Interaktion mit neuronalen Synapsen1,11,12. In Ermangelung der Glia bilden Neuronen eine begrenzte Anzahl von Synapsen, die in der Regel auch funktionale Reife13 fehlt.

Menschliche Astrozyten morphologischen, transkriptionelle und funktionellen Merkmale darstellen – wie zunehmende Größe und Komplexität der Verzweigung sowie artspezifische Gene –, sind nicht in Nagetieren12,14, rekapitulierte 15. Infolgedessen Studien unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete neuronalen Zellen werden akzeptiert als ein Mittel der CNS-Erkrankungen in-vitro- Prüfung, bei der Entwicklung neuartiger Therapien, Verletzungen Modelle und Kultur Paradigmen16 ,17. Darüber hinaus ermöglichen hPSCs die Studie der menschlichen Synapse Entstehung und Funktion ohne die Notwendigkeit für primäre Gewebe18,19.

Ein Hindernis zum Verständnis, wie verschiedene Zelltypen und Signale an synaptischen Schaltung Funktion beitragen ist der Mangel an entsprechenden Modellen des menschlichen Gehirns. Besteht ein Bedarf für eine geeignete Plattform zu ihrer synaptischen Netzwerke mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu rekapitulieren. Vor kurzem, hat Interesse in der Produktion von 3D Culture Systeme entstanden (allgemein bekannt als “Organellen,” “Sphäroide” oder “Mini-Köpfe”)20 bis komplexe dreidimensionale (3D) Modell Strukturen auf der zellulären und Makroebene. 3D Culture-Systeme behalten ECM und Zell-Zell-Interaktionen, die normalerweise nicht vorhanden oder nur während der typischen 2D Coculture Paradigmen21,22. Eine Fülle von Techniken existieren für die Kultivierung 3D neuronale Sphäroide23,24,25; jedoch erfordern viele langwierige Kultur Zeiträume (Monate bis Jahre) für spontane Entwicklung und Erhaltung der Layer, mit dem Benutzer präsentiert sehr wenig Kontrolle über den Ausgang.

Hier zeigen wir eine systematische Methode, um schnell und konsequent Biotechnologe neuronalen Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen (Pre-differenzierten Neuronen und Astrozyten) abgeleitet von hPSCs durch den Zusammenbau von Zellen in Bereich Kokulturen (“Asteroiden”)26 rekapitulieren, die Mensch-spezifische morphologische Komplexität in 3D. Dieses High-Density neuronalen System erzeugt gleichmäßig verteilten neuronalen Untertypen, die übernehmen ältere Eigenschaften im Laufe der Zeit und können gezeigt oder in gewissem Sinne Hochdurchsatz-untersucht. Wir zeigen erstmals, dass menschliche Astrozyten synaptischen Netzwerkaktivität platzen in dieser 3D Kokulturen induzieren. Darüber hinaus ist dieses Protokoll leicht anpassbar, Kugeln in verschiedenen Größen, um Zellen angegeben, um unterschiedlichen regionalen Identitäten des ZNS zu nutzen und Interaktionen von mehreren anderen Zelltypen wie gewünscht zu studieren zu generieren.

Protocol

(1) Zell-Kultur und Reagenz Vorbereitung Hinweis: Die Protokolle in diesem Abschnitt sind in der Reihenfolge geschrieben, in denen sie in der Differenzierung-Protokoll (Abschnitt 2 erscheinen). Sehen Sie die Tabelle der Materialien für Materialien und Katalognummern. Zellkultur beschichtete Platten vorbereiten. Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrix (ECM) Beschichtungslösung mit DMEM/F12 Medien 1 mg/mL Stammlösung vorbereiten. Aliquo…

Representative Results

Wenn Sie richtig durchgeführt wird, wird dieses Protokoll definierte Populationen von funktionalen Kokulturen Astrozyten28,33,34 und Neuronen35 aus hPSCs (Abbildung 1A-1C), erzeugt als produzieren. detaillierte zuvor26 und hier in Schritten 2.1-2.2 beschrieben. Dieses schrittweisen Verfahren, mit dem E…

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine systematische Methode zur Herstellung von 3D-Kugeln neuronale Kokulturen. Die Kugeln bestehen aus Astrozyten und Neuronen, die unabhängig von hPSCs abgeleitet werden. Obwohl nicht der Schwerpunkt dieses Protokolls, die Erzeugung von reinen Populationen von Astrozyten aus hPSCs28 ist ein entscheidender Schritt und technisch anspruchsvoll, wenn ohne Vorkenntnisse durchgeführt werden kann. Dieser erste Schritt bei der Erzeugung von diesen synaptischen Mikros…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten danken Dr. Erik Ullian (UCSF) für geistigen Beitrag auf die Gestaltung dieser Verfahren, Dr. Michael Ward (NIH) für technische Beratung bezüglich iNeuron Differenzierung und Saba Barlas für vorläufige Bildanalyse.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
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