मानव Pluripotent स्टेम सेल से Astrocytes और न्यूरॉन्स की 3डी Cocultures के साथ Synaptic Microcircuit मॉडलिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम असंबद्ध मानव pluripotent स्टेम सेल व्युत्पंन ंयूरॉंस और 3 डी क्षेत्र cocultures में एक साथ astrocytes, मुक्त अस्थाई स्थितियों में इन क्षेत्रों को बनाए रखने के संयोजन के लिए एक reproducible विधि का वर्णन है, और बाद में immunoanalysis और multielectrode सरणी रिकॉर्डिंग के साथ क्षेत्रों के synaptic सर्किट गतिविधि को मापने.
Abstract
कैसे विभिंन प्रकार के सेल और संकेतों को synaptic सर्किट समारोह में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक मॉडलों की कमी है । एक उभरती हुई प्रौद्योगिकी इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए तीन आयामी (3 डी) तंत्रिका कोशिका संस्कृतियों का उपयोग है, ‘ organoids ‘ या ‘ spheroids ‘, extracellular आसंजन अणुओं सहित सेलुलर बातचीत के दीर्घकालिक संरक्षण के लिए । हालांकि, इन संस्कृति प्रणालियों समय लेने और व्यवस्थित नहीं उत्पंन कर रहे हैं । यहां, हम विस्तार से एक तरीका तेजी से और लगातार मानव pluripotent स्टेम सेल से ंयूरॉंस और astrocytes के 3 डी cocultures का उत्पादन । पहले, पूर्व विभेदित astrocytes और न्यूरॉन progenitors असंबद्ध और गिना जाता है । अगले, कोशिकाओं के क्षेत्र में संयुक्त कर रहे है एक Rho-कळेनासे अवरोध करनेवाला और विशिष्ट अनुपात में reproducible आकार के क्षेत्रों के उत्पादन के साथ व्यंजन बनाने । चल क्षेत्रों के रूप में संस्कृति के कई हफ्तों के बाद, cocultures (‘ क्षुद्रग्रहों ‘) अंत में immunostaining के लिए खोदी या multielectrode arrays पर चढ़ाया synaptic घनत्व और शक्ति को मापने के लिए कर रहे हैं । सामांय में, यह उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल 3 डी तंत्रिका क्षेत्रों है कि परिपक्व सेल प्रकार प्रतिबंधित मार्करों प्रदर्शन उपज, कार्यात्मक synapses फार्म का, और प्रदर्शन सहज synaptic नेटवर्क फट गतिविधि होगा । एक साथ, इस प्रणाली monolayer संस्कृतियों की तुलना में एक अधिक उपयुक्त मॉडल में रोग के तंत्र में दवा जांच और जांच परमिट ।
Introduction
Astrocytes संरचनात्मक समर्थन से परे कार्यात्मक जिंमेदारियों की एक किस्म के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में glial कोशिका प्रकार हैं । घुलनशील synaptogenic कारकों और extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों के स्राव के माध्यम से, astrocytes स्थापना में सहायता और परिपक्व synapses के विकास के दौरान clustering1. उंहोंने यह भी extracellular संकेतन2,3,4,5के माध्यम से synapses के स्वास्थ्य और प्लास्टिक की व्यवस्था को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और समस्थिति की दीर्घकालिक स्थिरता के लिए योगदान extracellular पोटेशियम और ग्लूटामेट को विनियमित करके वातावरण, साथ ही ऊर्जा सब्सट्रेट और एटीपी6,7,8का स्राव । अंत में, वे extrasynaptic धाराओं9को प्रभावित करने के द्वारा neurotransmission के लिए योगदान कर सकते हैं, और अप्रत्यक्ष रूप से myelination10को बढ़ावा देने के रूप में अन्य सेल प्रकार के माध्यम से गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात, क्योंकि विषमता या astrocytes की शिथिलता कई neurodevelopmental सिंड्रोम और वयस्क neuropathology के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, वहां एक स्पष्ट करने के लिए इंजीनियर के भीतर न्यूरॉन्स के साथ astrocytes शामिल करने की जरूरत है तंत्रिका नेटवर्क के लिए आदेश में एक बेहतर अंतर्जात मस्तिष्क पर्यावरण के मॉडल । astrocytes की एक अभिंन विशेषता के लिए अपने ंयूरॉंस synapses1,11,12के साथ गतिशील बातचीत के फार्म की क्षमता है । glia के अभाव में, न्यूरॉन्स synapses की एक सीमित संख्या है, जो सामान्य रूप में भी कार्यात्मक परिपक्वता13कमी के रूप में.
मानव astrocytes प्रदर्शन रूपात्मक, transcriptional, और कार्यात्मक विशेषताओं-जैसे वृद्धि हुई आकार और शाखाओं में जटिलता के रूप में अच्छी तरह से प्रजातियों के रूप में विशेष जीन है कि कुतर12,14, में recapitulated नहीं कर रहे हैं, 15. नतीजतन, अध्ययन मानव pluripotent स्टेम सेल का उपयोग (hPSC)-तंत्रिका कोशिकाओं व्युत्पंन हो व्यापक रूप से सीएनएस में संबंधित रोगों की जांच के एक साधन के रूप में स्वीकार किए जाते है जबकि उपंयास उपचार, चोट मॉडल, और संस्कृति मानदंड16 विकसित ,17. इसके अलावा, hPSCs प्राथमिक ऊतक18,19के लिए की आवश्यकता के बिना मानव synapse गठन और समारोह के अध्ययन की अनुमति ।
कैसे विभिंन प्रकार के सेल और संकेतों को synaptic सर्किट समारोह में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा मानव मस्तिष्क के प्रासंगिक मॉडलों की कमी है । उच्च निष्ठा और reproducibility के साथ अपने synaptic नेटवर्क दोहराऊंगा करने के लिए एक उपयुक्त मंच की आवश्यकता है । हाल ही में, ब्याज 3 डी संस्कृति प्रणालियों के उत्पादन में उभरा है (मोटे तौर पर ‘ के रूप में जाना जाता organoids, ‘ ‘ spheroids, ‘ या ‘ मिनी दिमाग ‘)20 से मॉडल परिसर में तीन आयामी (3d) संरचनाओं सेलुलर और स्थूल स्तर पर । 3 डी संस्कृति प्रणालियों ECM और सेल सेल बातचीत है कि सामांय रूप से अनुपस्थित या ठेठ 2d coculture मानदंड21,22के दौरान सीमित है बनाए रखने के । तकनीक का एक बहुतायत संवर्धन 3 डी तंत्रिका spheroids23,24,25के लिए मौजूद; हालांकि, कई लंबे समय तक संस्कृति की आवश्यकता होती है (महीने साल के लिए) सहज विकास और परत संरक्षण के लिए, उत्पादन पर बहुत कम नियंत्रण प्रदर्शन उपयोगकर्ता के साथ ।
यहां, हम तेजी से और लगातार इंजन के लिए एक व्यवस्थित विधि वर्णन एकाधिक कोशिका प्रकार के बीच तंत्रिका बातचीत (पूर्व विभेदित न्यूरॉन्स और astrocytes) hPSCs से व्युत्पंन में कोशिकाओं द्वारा कोडांतरण क्षेत्र cocultures (‘ क्षुद्रग्रहों ‘)26 कि 3 डी में मानव विशिष्ट रूपात्मक जटिलताओं दोहराऊंगा । इस उच्च घनत्व तंत्रिका प्रणाली समान रूप से फैलाया तंत्रिका उपप्रकार है कि समय के साथ परिपक्व संपत्तियों पर ले और जांच की जा सकती है या एक उच्च प्रवाह तरीके से परख उत्पंन करता है । हम पहली बार है कि मानव astrocytes इन 3 डी cocultures में synaptic नेटवर्क फट गतिविधि प्रेरित के लिए प्रदर्शित करते हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आसानी से विभिंन आकारों के क्षेत्रों उत्पंन करने के लिए अनुकूलनीय है, सीएनएस के विभिंन क्षेत्रीय पहचान करने के लिए निर्दिष्ट कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए, और कई अंय प्रकार के सेल के संपर्क का अध्ययन करने के लिए वांछित के रूप में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम तंत्रिका cocultures के 3 डी क्षेत्रों के उत्पादन के लिए एक व्यवस्थित विधि का वर्णन । क्षेत्रों astrocytes और न्यूरॉन्स, जो स्वतंत्र रूप से hPSCs से प्राप्त कर रहे हैं से बना रहे हैं. हालांकि इस प्रोटो?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इन प्रक्रियाओं के डिजाइन पर बौद्धिक इनपुट के लिए डॉ एरिक Ullian (UCSF) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ माइकल वार्ड (NIH) iNeuron भेदभाव पर तकनीकी सलाह के लिए, और साबा बरलास प्रारंभिक छवि विश्लेषण के लिए ।
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
Referências
- Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
- Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
- Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
- Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
- Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
- Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
- Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
- Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
- Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
- Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neurociência. 334, 105-118 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 199-209 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
- Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
- Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
- Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
- Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
- Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
- Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
- Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
- Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
- Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).
