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Biologia do Desenvolvimento

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

このプロトコルの結合解離ひと多能性幹細胞由来神経細胞の再現性のある手法を目指して、アストロ サイト 3 D に一緒に球共培養系、これら球無料浮動小数点条件とその後の維持免疫分析によって行い電極の録音と球のシナプス回路活性を測定します。

Abstract

シナプス回路機能に貢献するさまざまなセルタイプおよび信号の私達の理解への障壁は、人間の脳の研究に関連するモデルの欠如です。この問題に対処する 1 つの新興技術、’organoids’ または ‘楕円’、細胞接着分子を含む細胞間相互作用の長期保全のためと呼ばれる 3 つの次元 (3 D) 神経細胞文化の使用であります。ただし、これらの文化のシステムは時間がかかり、体系的に生成されません。ここでは、我々 は急速にかつ一貫して神経細胞の三次元共培養系を生成する方法を詳しく説明、アストロ サイトひと多能性幹細胞。まず、あらかじめ差別化アストロ サイトと神経前駆細胞は解離し、カウントされます。球の形成にセルを結合する次に、Rho キナーゼ阻害剤と再現可能なサイズの球を生成する特定の比率の料理。浮球として文化の数週間後共培養系 (「小惑星」)、最後に染色の断面またはシナプス密度と強度を測定する多配列にメッキ。一般に、このプロトコルが制限されて成熟細胞型マーカーを表示機能性シナプスを形成、自発的なシナプス ネットワーク バースト活動の展示、3 D 神経球をもたらすことが期待されます。一緒に、このシステムは、単層培養と比較してより適切なモデルの薬剤のスクリーニングおよび病気のメカニズムへの調査を許可します。

Introduction

アストロ サイトは、さまざまな構造サポートを超える機能責任中枢神経系 (CNS) の中で非常に豊富なグリア細胞型。確立および開発1の中に成熟したシナプスのクラスタ リングによるシナプス形成可溶性因子と細胞外マトリックス (ECM) の分泌をアストロ サイトを支援します。彼らはまたから細胞外シグナル伝達2,3,4、5シナプスの可塑性、健康を維持するために重要な役割を果たすし、恒常性の長期的な安定性に貢献細胞外カリウム、グルタミン酸とエネルギー基質および ATP6,7,8の分泌を調節することによって環境。最後に、彼らは櫛谷電流9に影響を与える神経伝達に貢献できる、髄鞘化10の推進など他のセルタイプを通じた活動に直接に影響を与えることができます。重要なは、異常やアストロ サイトの機能不全は、多くの神経発達症候群や成人神経につながることができます、ので、改良するために設計された神経回路網内のニューロンとアストロ サイトを含めるには明白な必要性内因性の脳環境のモデル。アストロ サイトの不可欠な特性は、神経シナプス1,11,12フォーム動的相互作用する能力です。グリア細胞がない場合は、ニューロンは、シナプスは、一般的にも不足機能成熟度13の限られた数を形成します。

人間のアストロ サイト、転写、形態学的および機能的特性を表示-増加のサイズと、分岐として種特異的な遺伝子の複雑さなど-ことがない齧歯動物12,14で締めくくっています。 15。その結果、ひと多能性幹細胞 (hPSC) を利用した研究-派生神経細胞文化パラダイム16 や傷害モデル、新規治療法を開発しながら培養中枢神経系疾患を調べる手段として広くなるが ,17。さらに、hPSCs は、人間のシナプス形成と一次組織18,19を必要とせず関数の研究を許可します。

シナプス回路機能に貢献するさまざまなセルタイプおよび信号の理解にバリアは、人間の脳の関連モデルの欠如です。そのシナプス ネットワーク高再現性と再現性を要約する適切なプラットフォームの必要性があります。3次元培養システムの生産に関心が最近、浮上している (‘organoids、’ として広く知られている「回転楕円体、’ または ‘ミニ脳’) 携帯とマクロのレベルで構造の複雑な三次元 (3 D) をモデル化する20 。3次元培養システムは、典型的な 2D 共パラダイム21,22の中には通常不在か限られた ECM と細胞間の相互作用を保持します。テクニックの豊富さは 3 D 神経スフェロイド23,24,25; を養殖、します。しかし、多くは長い培養期間を必要とする (月への年) 自発的な開発とレイヤー保存、ユーザーと出展出力を非常に小さな制御。

ここでは、急速に体系的な方法を示すし、一貫して複数の細胞のタイプ (前分化ニューロンとアストロ サイト) 間強酸細胞間相互作用に由来する hPSCs 球共培養系 (「小惑星’)26 に細胞を組み立てることによって3 D で人間固有の形態学的複雑さを要約します。この高密度の神経システムは、時間をかけて成熟したプロパティとすることができます上映または高スループット方法で試金される均等に分散ニューラル サブタイプを生成します。初めて人間のアストロ サイトがこれらの三次元共培養系におけるシナプス ネットワーク バースト活動を誘発することを示す.さらに、このプロトコルは、中枢神経系の地域別の id に指定されたセルを利用して必要に応じて他の複数の細胞型の相互作用を研究する、異なるサイズの球体を生成に容易に適応。

Protocol

1. 細胞培養と試薬の準備 注: このセクションのプロトコルは、分化プロトコル (セクション 2) の順番で記述されます。材料のカタログ番号材料表を参照してください。 細胞培養のコーティング プレートを準備します。 1 mg/mL の原液を準備する DMEM/F12 メディアで細胞外マトリックス (ECM) コーティング液を希釈します。分注希釈 ECM…

Representative Results

正しく実行される、アストロ サイト28,33,34とニューロンの35 (図 1 a-1C)、hPSCs から生成された機能共培養系の定義された集団としてこのプロトコルを生成します。以前26の詳細し、手順 2.1-2.2 でここで説明します。マイクロウェ?…

Discussion

このプロトコルでは神経共培養系の 3 D 球の生産のための体系的な方法をについて説明します。球は hPSCs から独立して派生はニューロンとアストロ サイトので構成されます。しかしこのプロトコルのフォーカスではない、hPSCs28からアストロ サイトの純粋な人口の世代の重要なステップし、経験することがなく実行される場合、技術的に挑戦することができます。これらの?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

博士マイケル区 (NIH) iNeuron 分化に関する技術的な助言のため、予備的な画像解析のサバ Barlas これらのプロシージャの設計上の知的入力を博士エリック Ullian (UCSF) に感謝したいと思います。

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
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