JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Biologia do Desenvolvimento

Synaptiske Microcircuit modellering med 3D Cocultures av astrocyttene og Neurons fra menneskelige Pluripotent stamceller

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

I denne protokollen, vi tar sikte på å beskrive en reproduserbar metode for å kombinere dissosiert menneskelige pluripotent stilk cellen avledet nevroner og astrocyttene sammen i 3D sphere cocultures, opprettholde disse kuler i gratis flytende forhold, og senere måle synaptic krets aktivitet av kulene med immunoanalysis og multielectrode matrise innspillinger.

Abstract

En barriere til vår forståelse av hvordan ulike celletyper og signaler bidrar til synaptic krets funksjon er mangelen på aktuelle modeller for å studere den menneskelige hjernen. En ny teknologi som løser dette problemet er bruk av tre-dimensjonale (3D) nevrale cellekulturer, kalt ‘organoids’ eller ‘spheroids’, for langsiktig bevaring av intercellulære interaksjoner inkludert ekstracellulære vedheft molekyler. Disse kultur systemene er imidlertid tidkrevende og ikke systematisk generert. Her vi detalj en metode for å raskt og konsekvent produserer 3D cocultures av neurons og astrocyttene fra menneskelige pluripotent stamceller. Første, pre differensiert astrocyttene neuronal progenitors avstand og telt. Deretter celler kombineres i sfæren-forming retter med en Rho-Kinase inhibitor og spesifikke formater å produsere sfærer av reproduserbar størrelse. Etter flere uker med kultur som flytende sfærer, er cocultures (“asteroider”) delt for immunostaining eller belagt på multielectrode matriser for å måle synaptic tetthet og styrke. Generelt er det forventet at denne protokollen vil gi 3D nevrale sfærer som vise eldre celle-type begrenset markører, danne funksjonelle synapser og utstillingen spontan synaptic burst nettverksaktivitet. Sammen tillater dette systemet narkotikarelaterte screening og etterforskning mekanismer av sykdom i en mer passende modell sammenlignet monolayer kulturer.

Introduction

Astrocyttene er en svært rikt glial celle type i sentralnervesystemet (CNS) med en rekke funksjonelle ansvar utover strukturell støtte. Gjennom sekresjon av løselig synaptogenic faktorer og ekstracellulær matrix (EFM) komponenter, astrocyttene hjelp i etableringen og klynger av modne synapser under utvikling1. De også spille en avgjørende rolle i å opprettholde helse og plastisitet av synapser gjennom ekstracellulære signalnettverk2,3,4,5, og bidra til langsiktig stabilitet av homøostatisk miljøer ved å regulere ekstracellulære kalium og glutamat, samt utskillelsen av energi underlag og ATP6,7,8. Til slutt, de kan bidra til neurotransmission ved å påvirke extrasynaptic strøm9og kan indirekte påvirke aktivitet gjennom andre celletyper som fremmer myelination10. Viktigst, fordi unormalt eller dysfunksjon av astrocyttene kan føre til mange neurodevelopmental syndromer og voksen neuropathology, er det et åpenbart behov inkludere astrocyttene sammen med nevroner i utvikling neural nettverk for at en forbedret modell av endogene hjernen miljøet. En integrert karakteristisk for astrocyttene er deres evne til skjemaet dynamisk interaksjoner med neuronal synapser1,11,12. I fravær av glia danne nerveceller et begrenset antall synapser, som generelt mangler også funksjonelle modenhet13.

Menneskelige astrocyttene vise morfologiske, transcriptional og funksjonelle egenskaper-som økt størrelsen og kompleksiteten av forgrening, samt artsspesifikke gener-det er ikke recapitulated i Red12,14, 15. Resultatet studier utnytte menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede neural celler har blitt allment akseptert som et middel til å undersøke CNS-relaterte sykdommer i vitro samtidig utvikle romanen terapi, skader modeller og kultur paradigmer16 ,17. Videre at hPSCs studiet av menneskelig synapse dannes og funksjon uten behov for primære vev18,19.

En barriere til vår forståelse av hvordan ulike celletyper og signaler bidrar til synaptic krets funksjon er mangelen på relevante modeller av den menneskelige hjernen. Det er behov for en passende plattform å recapitulate synaptic klyngeutvikling med Hi-Fi og reproduserbarhet. Nylig interesse har dukket opp i produksjonen av 3D kultur systemer (bredt kjent som ‘organoids’, ‘spheroids’ eller ‘mini hjerner’)20 modell komplekse tredimensjonale (3D) strukturer på mobilnettet og makro. 3D kultur systemer beholder ECM og celle-celle interaksjoner som normalt fraværende eller begrenset i typisk 2D coculture paradigmer21,22. Det finnes en rekke teknikker for dyrking 3D nevrale spheroids23,24,25; men mange krever lengre kultur perioder (måneder til år) for spontane utvikling og lag bevaring, med brukeren viser svært liten kontroll over resultatet.

Her vi illustrerer en systematisk metode for å raskt og konsekvent bioengineer nevrale interaksjon mellom flere celletyper (pre differensiert nevroner og astrocyttene) avledet fra hPSCs ved å sette sammen cellene i området cocultures (“asteroider”)26 som recapitulate menneske-spesifikke morfologiske kompleksiteten i 3D. Høy tetthet nevrale systemet genererer jevnt spredt nevrale undertypene som ta på eldre egenskaper over tid og kan vist eller assayed på en høy gjennomstrømming måte. Vi viser for første gang at menneskelige astrocyttene induserer synaptiske nettverksaktivitet brast i disse 3D cocultures. I tillegg er denne protokollen lett tilpasses generere sfærer av forskjellige størrelser, utnytte celler angitt for ulike regionale identiteten til CNS og studere interaksjoner av flere andre celletyper som ønsket.

Protocol

1. celle kultur og forberedelse av reagenser Merk: Protokollene i denne delen er skrevet i rekkefølgen de vises i differensiering protokollen (inndeling 2). Se Tabellen for materiale for materialer og katalogfilene tall. Forberede belagt plater cellekultur. Fortynne ekstracellulær matrix (EFM) belegg løsning med DMEM/F12 media å forberede en 1 mg/mL lagerløsning. Aliquot utvannet ECM lagerløsning inn 30 konisk rørene 3 ml og umiddel…

Representative Results

Når utført riktig, vil denne protokollen produsere definerte bestander av funksjonelle cocultures astrocyttene28,33,34 og neurons35 generert fra hPSCs (figur 1A-1C), som detaljert tidligere26 og beskrevet her i trinn 2.1-2.2. Dette trinnvis prosedyre, med bruk av microwell plater, forventes å gi 3D n…

Discussion

I denne protokollen beskriver vi en systematisk metode for produksjon av 3D Sfærer av nevrale cocultures. Kulene er sammensatt av astrocyttene og neurons, som er avledet uavhengig fra hPSCs. Om ikke fokusere denne protokollen, generering av ren bestander av astrocyttene fra hPSCs28 er et kritisk punkt og kan være teknisk utfordrende hvis utført uten tidligere erfaring. Dette første trinnet i generasjon av disse synaptic microcircuits skal utføres med grundig timing og oppmerksomhet på detalj…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Dr. Erik Ullian (UCSF) for intellektuell inndata på utformingen av disse prosedyrene, Dr. Michael Ward (NIH) for tekniske råd om iNeuron differensiering og Saba Barlas for foreløpige bildeanalyser.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neurociência. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Synaptic Microcircuit3D CoculturesAstrocytesNeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Cell TypesSynaptic Circuit FormationNeurociênciaOrganoid TechnologiesDrug DevelopmentNeuroregenerationNeural ProgenitorsAstrocyte ProgenitorsAstrocyte SubtypesNeural InductionNeural MediumRho-kinase InhibitorECM-coated PlatesCell AggregationCell DissociationCell Identity ConfirmationCryo-preservation
check_url/pt/58034?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image