Summary

Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Published: August 16, 2018
doi:

Summary

I detta protokoll, vi strävar efter att beskriva en reproducerbar metod för att kombinera dissocierade mänskliga pluripotenta stamceller som härrör nervceller och astrocyter tillsammans i 3D sfär cocultures, bibehålla dessa sfärer i fri svävande villkor, och därefter mäta synaptic krets aktiviteten av sfärer med immunoanalysis och multielectrode array inspelningar.

Abstract

Ett hinder för vår förståelse av hur olika celltyper och signaler bidrar till synaptic krets funktion är bristen på relevanta modeller för att studera den mänskliga hjärnan. En ny teknik som löser problemet är användningen av tre dimensionell (3D) neurala cellkulturer, kallas ‘organoids’ eller ‘spheroids’, för långsiktigt bevarande av intercellulära interaktioner inklusive extracellulära adhesionsmolekyler. Dessa kultur-system är dock tidskrävande och inte systematiskt genererade. Här vi detalj en metod för att snabbt och konsekvent producera 3D cocultures nervceller och astrocyter från mänskliga pluripotenta stamceller. Första, före differentierade astrocyter och neuronala stamfäder är separerade och räknade. Nästa, celler kombineras i sfär-bilda rätter med en Rho-tyrosinkinashämmare och specifika nyckeltal att producera sfärer av reproducerbara storlek. Efter flera veckor av kultur som flytande klot, är cocultures (‘asteroider’) Slutligen sektioneras för immunfärgning eller förkromad vid multielectrode matriser för att mäta synaptisk densitet och styrka. Det förväntas allmänt att detta protokoll kommer att ge 3D neurala sfärer som Visa mogen cell-typ begränsad markörer, bilda funktionella synapser och uppvisar spontana synaptic nätverksaktivitet burst. Tillsammans, tillåter detta system drogkontroll och utredningar av mekanismer av sjukdom i en mer lämplig modell jämfört med enskiktslager kulturer.

Introduction

Astrocyter är en mycket riklig glial celltyp inom det centrala nervsystemet (CNS) med en mängd funktionella ansvar bortom strukturellt stöd. Genom utsöndring av lösliga synaptogenic faktorer och extracellulär matrix (ECM) komponenter, astrocyter stöd i upprättandet och klustring av mogen synapser under utveckling1. De också spelar en avgörande roll i att upprätthålla hälsa och plasticitet i synapser till extracellulära signalering2,3,4,5, och bidrar till långsiktiga stabilitet homeostatiska miljöer genom att reglera extracellulära kalium och glutamat, samt utsöndringen av energisubstrat och ATP6,7,8. Slutligen, de kan bidra till neurotransmission genom att påverka extrasynaptic strömmar9och kan indirekt påverka verksamhet genom andra celltyper som främjande myelinisering10. Ännu viktigare, eftersom abnormitet eller dysfunktion av astrocyter kan leda till många neurologiska syndrom och vuxen neuropatologi, finns det ett uppenbart behov av att inkludera astrocyter tillsammans med nervceller inom bakåtkompilerade neurala nätverk för en förbättrad modell av endogena hjärnan miljön. En integrerad kännetecken av astrocyter är deras förmåga att bilda dynamisk interaktion med nervcellernas synapser1,11,12. I avsaknad av glia bildar nervceller ett begränsat antal synapser, som i allmänhet också saknar funktionell mognad13.

Mänskliga astrocyter uppvisar morfologiska, transkriptionell och funktionella egenskaper — såsom ökad storlek och komplexitet av förgrenade, liksom artspecifika gener — som är inte återgetts i gnagare12,14, 15. Som ett resultat, studier utnyttja mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda neurala celler har blivit allmänt accepterat som ett medel för att undersöka CNS-relaterade sjukdomar i vitro samtidigt utveckla nya terapier, skada modeller och kultur paradigm16 ,17. Dessutom tillåter hPSCs studiet av mänskliga synaps bildning och funktion utan behov av primära vävnad18,19.

Ett hinder för vår förståelse av hur olika celltyper och signaler bidrar till synaptic krets funktion är bristen på relevanta modeller av den mänskliga hjärnan. Det finns ett behov av en lämplig plattform för att sammanfatta dess synaptic nätverk med HiFi och reproducerbarhet. Nyligen, intresse vuxit fram i produktionen av 3D kultur system (allmänt känt som ‘organoids,’ ‘spheroids’ eller ‘mini hjärnor’)20 att modellera komplexa tredimensionella (3D) strukturer på cellulär och makro. 3D kultur system behåller ECM och cell-cell interaktioner som är normalt frånvarande eller begränsad under typiska 2D coculture paradigm21,22. Ett överflöd av tekniker finns för odling 3D neurala spheroids23,24,25; men många kräver långa kultur perioder (månader till år) för spontan utveckling och lager bevarande, med användaren uppvisar mycket liten kontroll över produktionen.

Här vi illustrera en systematisk metod för att snabbt och konsekvent bioengineer neurala interaktioner bland flera celltyper (pre differentierade nervceller och astrocyter) härstammar från hPSCs genom montering celler i området cocultures (‘asteroider’)26 som recapitulate mänskliga-specifika morfologiska komplexiteten i 3D. Detta högdensitets neurala system genererar jämnt spridda neurala undertyper som ta på mogen egenskaper över tiden och kan screening eller analyserats på ett sätt som hög genomströmning. Vi visar för första gången att mänskliga astrocyter inducerar synaptic burst nätverksaktivitet i dessa 3D cocultures. Detta protokoll är dessutom lätt att anpassa till generera sfärer av olika storlekar, att utnyttja celler som anges till olika regionala identiteter i CNS, och att studera interaktioner mellan flera andra celltyper som önskas.

Protocol

1. cell kultur och REAGENSBEREDNING Obs: Protokollen i detta avsnitt är skrivna i den ordning som de visas i protokollet differentiering (avsnitt 2). Se Tabell för material för material och katalognummer. Förbereda plattorna för cellodling. Späd extracellulär matrix (ECM) beläggning lösningen med DMEM/F12 media att förbereda en 1 mg/mL stamlösning. Alikvotens utspädda ECM stamlösning till 30 koniska rör 3 mL varje och omedelb…

Representative Results

När de utförs korrekt, kommer att detta protokoll producera definierade populationer av funktionella cocultures astrocyter28,33,34 och nervceller35 genereras från hPSCs (figur 1A-1C), som detaljerade tidigare26 och beskrivs här i steg 2.1-2.2. Detta stegvis förfarande, med användning av mikrobrunn…

Discussion

I detta protokoll beskriver vi en systematisk metod för produktion av 3D sfärer av neurala cocultures. Sfärernas består av astrocyter och nervceller, som självständigt härledas från hPSCs. Men inte i fokus för detta protokoll, generering av ren populationer av astrocyter från hPSCs28 är ett viktigt steg och det kan vara tekniskt svårt om det görs utan tidigare erfarenhet. Detta första steg i generationen av dessa synaptic mikrokretsar bör utföras med noggrann timing och uppmärksam…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Dr Erik Ullian (UCSF) för intellektuell ingång på utformningen av dessa förfaranden, Dr Michael Ward (NIH) för teknisk rådgivning om iNeuron differentiering och Saba Barlas för preliminära bildanalys.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

Referências

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neurociência. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).
check_url/pt/58034?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).

View Video