Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile
Summary
Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.
Abstract
İnsan beyni çalışmak için ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Bu soruna yönelik bir gelişen teknoloji ‘organoids’ veya ‘pulcuklarının’, hücreler arası etkileşimler de dahil olmak üzere hücre adezyon molekülleri uzun vadeli korunması için ifade edilen üç boyutlu (3D) sinir hücre kültürleri, kullanmaktır. Ancak, bu kültür zaman alıcı ve sistematik olarak oluşturulan sistemlerdir. Burada, biz hızla ve sürekli nöronların 3D cocultures üretmek için bir yöntem detay ve astrocytes gelen insan pluripotent kök hücre. İlk, önceden farklılaşmış astrocytes ve nöronal ataları ayrışmış ve sayılır. Küre-oluşturan hücreler daha sonra birleştirilir yemekleri ile bir Rho-kinaz inhibitörü ve küreler tekrarlanabilir boyutta üretmek için belirli oranları. Kültür kayan küreler olarak birkaç hafta sonra cocultures (‘asteroitler’) son olarak immunostaining için kesitli veya sinaptik yoğunluğu ve gücü ölçmek için multielectrode diziler kaplama. Genel olarak, bu protokol olgun hücre türü kısıtlanmış işaretleyicileri görüntülemek, fonksiyonel sinapslarda formu ve spontan sinaptik ağ veri bloğu aktivite sergilemek 3D sinirsel küreler verecektir bekleniyor. Birlikte, bu sistem uyuşturucu tarama ve mekanizmaları soruşturmalar hastalığının monolayer kültürlere göre daha uygun bir model izin verir.
Introduction
Astrocytes pek çok yapısal destek ötesinde fonksiyonel sorumlulukları ile merkezi sinir sistemi (MSS) içinde son derece bol gliyal hücre tipi vardır. Salgılanması çözünür synaptogenic faktörler ve hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerinin kurulması ve geliştirme1sırasında olgun sinapslarda kümeleme astrocytes yardım. Ayrıca sağlık ve plastisite sinapslarda ile hücre dışı sinyal2,3,4,5kritik bir rol oynamaktadır ve homeostatik için uzun vadeli istikrar katkıda hücre dışı potasyum ve glutamat yanı sıra enerji yüzeylerde ve ATP6,7,8salgılanmasını düzenleyerek ortamlar. Son olarak, onlar için neurotransmission extrasynaptic akımları9etkileyen tarafından katkıda bulunabilir ve etkinlik myelination10teşvik gibi diğer hücre türleri aracılığıyla dolaylı olarak etkileyebilir. Önemlisi, anormallik veya astrocytes disfonksiyon birçok nörogelişimsel sendromları ve yetişkin nevropatoloji yol açabilir çünkü sırayla için geliştirilmiş bir astrocytes nöronlar mühendislik sinir ağları içinde yanında dahil etmek için bir açık gerek yoktur endojen beyin çevre modeli. Astrocytes ayrılmaz bir özelliği ile nöronal sinapslarda1,11,12formu dinamik etkileşimler için onların yeteneğidir. Glia yokluğunda, genel de fonksiyonel olgunluk13eksikliği sinapslarda sınırlı sayıda neurons oluşturur.
İnsan astrocytes, transkripsiyon, morfolojik ve fonksiyonel özellikleri görüntülemek — artan büyüklüğü ve karmaşıklığı dallanma, hem de species-specific gen gibi — kemirgenler12,14‘, değil recapitulated 15. Sonuç olarak, çalışmalar insan pluripotent kök hücre (hPSC) kullanan-türetilmiş sinir hücreleri haline yaygın olarak kabul yeni tedaviler, yaralanma modelleri ve kültür paradigmalar16 geliştirirken CNS bağlı hastalıklar vitro incelenmesi aracı olarak ,17. Ayrıca, hPSCs insan synapse oluşumu ve işlev birincil doku18,19gerek kalmadan çalışma izni.
İnsan beyninin ilgili modellerin eksikliği bizim anlayış nasıl çeşitli hücre tipleri ve sinyalleri sinaptik devre işleve katkıda bulunmak için bir engeldir. Yüksek sadakat ve tekrarlanabilirlik ile onun sinaptik ağları özetlemek uygun bir platform için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, faiz 3D kültür sistemleri üretiminde ortaya çıkmıştır (genel olarak ‘organoids’ bilinen ‘pulcuklarının’ veya ‘mini beyin’) karmaşık üç boyutlu (3D) modelleme20 yapıları cep ve makro düzeyde. 3D kültür sistemleri tipik 2D coculture paradigmalar21,22sırasında normalde bulunmadığından veya sınırlı ECM ve hücre-hücre etkileşimleri korur. Teknikleri bir bolluk var 3D sinirsel pulcuklarının23,24,25kültür için; Ancak, birçok uzun kültür dönemleri gerektirir (ay-yıl) spontan gelişimi ve katman korunması için Kullanıcı ile çok az çıktı üzerinde denetime sergilenmesi.
Burada, biz hızlı bir şekilde sistematik bir yönteme göstermek ve sürekli genetiğinin sinirsel etkileşim arasında birden çok hücre tipleri (önceden farklı nöronlar ve astrocytes) hPSCs küre cocultures (‘asteroitler’)26 hücreleri birleştirerek elde edilen 3D insan özgü morfolojik karmaşıklığı özetlemek. Bu yüksek yoğunluklu sinir sistemi zamanla olgun özellikleri almak ve ekranlı veya bir yüksek-den geçerek şekilde denetlesinler eşit dağınık sinirsel alt türlerini oluşturur. Biz insan astrocytes sinaptik ağ veri bloğu etkinliğinde bu 3D cocultures neden ilk kez göstermek. Ayrıca, bu iletişim kuralını küreler farklı boyutlarda, farklı bölgesel MSS kimliklere belirtilen hücreleri kullanmak ve istediğiniz gibi birden çok hücre tiplerinin etkileşimleri çalışmaya oluşturmak için kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için sinirsel cocultures 3D küre imalatı için sistematik bir yöntem açıklanmaktadır. Küre astrocytes ve bağımsız olarak hPSCs elde edilen neurons oluşur. Odağı değil bu protokol rağmen saf astrocytes hPSCs28 üzerinden olasılığını nesil kritik bir adımdır ve deneyiminiz gerçekleştirdiyseniz Teknik olarak zor olabilir. Bu ilk adım bu sinaptik Mikri şemalar nesil titiz zamanlama ve detaylara dikkat ile yapılmalıdır. HPSC elde edilen astrocytes kullanımı u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Erik Ullianlıların (UCSF) tasarımı iNeuron farklılaşması üzerine teknik danışmanlık için Dr Michael Ward (NIH) ve Saba Barlas ön görüntü analizi için bu yordamları, entelektüel girişi için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
Referências
- Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
- Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
- Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
- Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
- Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
- Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
- Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
- Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
- Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
- Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neurociência. 334, 105-118 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologia do Desenvolvimento. 420 (2), 199-209 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
- Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
- Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
- Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
- Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
- Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
- Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
- Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
- Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
- Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).
