En direkte Force Probe for å måle mekanisk integrasjon mellom kjernen og Cytoskeleton
Summary
I denne protokollen beskriver vi en brønnene metode for å direkte bruke en kontrollert kraft på kjernen i en levende celle. Denne analysen kan avhør av kjernefysiske mekaniske egenskaper i levende, tilhenger cellen.
Abstract
Mekaniske egenskaper for kjernen bestemme sitt svar på mekaniske krefter generert i celler. Kjernen er molecularly kontinuerlig med cytoskjelett, for metoder å undersøke sin mekanisk oppførsel i tilhenger celler. Her diskuterer vi direkte force sonden (DFP) som et verktøy for å bruke makt direkte til kjernen i en levende tilhenger celle. Vi legger smale brønnene til kjernefysiske overflaten med sugekraft. Brønnene er oversatt fra kjernen, som forårsaker kjernen å deformere og oversette. Når gjenopprette er lik sugekraft styrken, kjernen løsner og slapper elastisk. Fordi inntaks press er nøyaktig kjent, er styrken på kjernefysiske overflaten kjent. Denne metoden har avdekket at nano-skala styrker er tilstrekkelig å deformere og oversette kjernen i tilhenger celler, og identifisert cellen cytoskjelett elementer som aktiverer kjernen å motstå styrker. DFP kan brukes å analysere bidrag av mobilnettet og kjernefysiske komponenter kjernefysiske mekaniske egenskaper i levende celler.
Introduction
Patologi som kreft innebære endringer i kjernefysiske form og struktur1,2, som er vanligvis ledsaget av en “mykgjøringen” av kjernen3,4. Kjernefysiske motstand mot mekanisk deformasjon har vært generelt karakterisert ved å bruke en isolert kjerner5.
Kjernen i celler er molecularly knyttet til cytoskjelett Linker av Nucleoskeleton og Cytoskeleton (LINC) komplekse6,7,8,9. Resultatet er kjernen mekanisk integrert med cytoskjelett, og gjennom celle-undergrunnen adhesjon, den ekstracellulære matrisen. Mekanisk prøvende kjernen i tilhenger cellene kan gi innsikt i mekanisk integrering. Metoder for å manipulere kjerner i levende celler inkluderer brønnene aspirasjon10,11og atomic force mikroskopi12,13,14. Vi har nylig beskrevet en direkte force sonde (DFP) som gjelder mekaniske krefter på kjernen i en levende tilhenger celle15.
Her skissere vi fremgangsmåten for å bruke et microinjection system som er allment tilgjengelig i mikroskopi anlegg å bruke en kjent, nano-skala mekanisk kraft direkte på kjernen i en tilhenger celle. En femtotip (0,5 µm diameteren brønnene tips) er montert og koblet til microinjection systemet med et rør. Spissen, plassert i en vinkel på 45 grader i forhold til overflaten av kultur fatet, senkes til ved siden av kjernefysiske overflaten. Røret er deretter koblet og åpnet i atmosfæren, som skaper en negativ inntaks press på kjernefysiske overflaten og sel brønnene spissen mot kjernefysiske overflaten. Gjennom oversettelse brønnene tips, er kjernen deformert og til slutt (avhengig av omfanget av kraften), løsrevet fra brønnene. Denne avdeling oppstår når de gjenopprette (motstå) styrkene, utøves av kjernen og celle, lik sugekraft kraften fra brønnene. Analyse kan utføres ved å måle forskyvning av kjernen, lang stamme (formel 1) eller området belastningen (figur 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Måle mekanisk integrering av kjernen med cytoskeleton er en utfordring for nyeste metoder, for eksempel brønnene aspirasjon16, fordi de krever enten isolert kjerner (der kjernen er avparet fra cytoskeleton) eller kjerner i suspendert celler (der ekstracellulære styrker, som trekkraft styrker, er fraværende). Force utlignet til kjernen ved å bruke biaxial belastning celler tilhenger til en membran17,18; men er denne teknikken begrenset…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 EB014869.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
Referências
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
