En direkt tvång sond för mätning av mekaniska Integration mellan kärnan och cytoskelettet
Summary
I detta protokoll beskriver vi en mikropipett metod för att direkt tillämpa en kontrollerad kraft till kärnan i en levande cell. Denna analys kan förhör av nuclear mekaniska egenskaper i cellen levande, vidhäftande.
Abstract
De mekaniska egenskaperna av kärnan avgör dess svar på mekaniska krafter genereras i celler. Eftersom kärnan är molekylärt kontinuerlig med cytoskelettet, behövs metoder att undersöka dess mekaniska beteende i vidhäftande celler. Här diskuterar vi direkt tvång sonden (DFP) som ett verktyg för att applicera kraft direkt till kärnan i en levande fastsittande cell. Vi lägger en smal mikropipett på nukleära ytan med sug. Mikropipett översätts från kärnan, som orsakar kärnan att deformera och översätta. När återställa styrkan är lika med sugstyrka, kärnan lossnar och slappnar elastiskt. Eftersom sugtrycket är just känd, är kraften på nukleära ytan känd. Denna metod har avslöjat att nano-skala krafter räcker för att deformera och översätta kärnan i vidhäftande celler, och identifierade cytoskeletal element som gör att kärnan att motstå krafter. DFP kan användas att dissekera bidrag av cellulära och nukleära komponenter till nuclear mekaniska egenskaper i levande celler.
Introduction
Sjukdomar såsom cancer innebära ändringar av nukleära form och struktur1,2, som vanligen åtföljs av en ‘mjukgörande’ av nucleus3,4. Nukleära motståndskraft mot mekanisk deformation karaktäriserats generellt genom att tillämpa en kraft på isolerade atomkärnor5.
Kärnan i celler är molekylärt ansluten till cytoskelettet av Linker av Nucleoskeleton och cytoskelettet (LINC) komplexa6,7,8,9. Som ett resultat, är kärnan mekaniskt integrerad med cytoskelettet och genom cell-underskikt sammanväxningar, extracellulärmatrix. Mekaniskt sondera kärnan inuti vidhäftande celler kan ge insikt i denna mekaniska integration. Metoder att manipulera kärnor i levande celler inkluderar mikropipett aspiration10,11, och atomic force microscopy12,13,14. Vi har nyligen beskrivit en direkt tvång sond (DFP) som gäller mekaniska krafter direkt på kärnan i en levande fastsittande cell15.
Här, beskriver vi förfarandet för ett Mikroskop system som är allmänt tillgänglig i mikroskopi faciliteter att tillämpa en känd, nano-skala mekanisk kraft direkt till kärnan i en fastsittande cell. En femtotip (0,5 µm diameter mikropipett spets) är monterade och anslutna till Mikroskop systemet av ett rör. Spetsen, placerad i en 45° vinkel i förhållande till ytan av kultur skålen, sänks tills anslutning till nukleära ytan. Röret är sedan kopplas bort och öppnade till atmosfären, vilket skapar ett sug undertryck på nukleära yta och förseglar mikropipett spetsen mot kärnkraft ytan. Genom översättning av mikropipett spetsen, är kärnan deformerade och så småningom (beroende på omfattningen av kraft tillämpas), fristående från mikropipett. Här lossnar uppstår när de återställa (motstånd) krafter, som utövas av kärnan och cell, lika sug kraften som tillförs av en mikropipett. Analys kan utföras genom att mäta förskjutningen av kärnan, den längd stammen (ekvation 1), eller området stammen (figur 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Mätning mekanisk integrering av kärnan med cellskelettet är en utmaning för mest aktuella metoder, såsom mikropipett aspiration16, eftersom de kräver antingen isolerade atomkärnor (där kärnan är frikopplade från cytoskelettet) eller kärnor i suspenderade celler (där extracellulära krafter, såsom dragkraft styrkor, är frånvarande). Kraft har tillämpats till kärnan genom att tillämpa biaxiell stam celler anhängare till en membran17,<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH R01 EB014869.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
Referências
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
