Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ
Summary
Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.
Abstract
Con la creciente prevalencia de enfermedades neurodegenerativas, es cada vez más importante comprender la fisiopatología subyacente que conduce a la pérdida y disfunción neuronal. Tecnologías y herramientas de imágenes basadas en fluorescencia permiten análisis sin precedentes de los procesos neurobiológicos subcelulares, pero todavía hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes . Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes basados en fluorescencia usando modelos de Drosophila de la neurodegeneración. Específicamente, se describe un enfoque fácil de seguir, semiautomático con Fiji/ImageJ para analizar dos procesos celulares: en primer lugar, cuantificar el contenido total de proteína y perfil en el lóbulo óptico de Drosophila mediante etiquetado fluorescente mutante proteínas huntingtina; y en segundo lugar, evaluar flujo de autofagia-lisosoma en el sistema visual de Drosophila con cuantificación basada en radiométrica de un reportero fluorescente de tándem de la autofagia. Importante, el protocolo descrito aquí incluye un paso de segmentación semiautomática para asegurar que todas las estructuras fluorescentes se analizan para reducir al mínimo el sesgo de selección y para aumentar la resolución de comparaciones sutiles. Este enfoque puede ser extendido para el análisis de otras estructuras biológicas de la célula y procesos implicados en la neurodegeneración, como proteico puncta (gránulos de estrés y complejos sinápticos), compartimentos, así como unida a la membrana (mitocondrias y vesículas tráfico de membrana). Este método proporciona un estándar, pero adaptable punto de referencia para análisis de imagen y cuantificación y podría facilitar la confiabilidad y reproducibilidad a través del campo y en última instancia, mejorar la comprensión mecanicista de la neurodegeneración.
Introduction
Las enfermedades neurodegenerativas afectan a millones de personas cada año y la incidencia está aumentando con un envejecimiento población1. Mientras que cada enfermedad neurodegenerativa tiene una etiología única, agregación de proteínas mal plegadas y avería de la red proteostasis son características distintivas patológicas común de muchas de estas enfermedades. Dilucidar cómo la interrupción de estos procesos fundamentales e interrelacionados va mal contribuir a la muerte neuronal de la célula y disfunción es fundamental para entender las enfermedades neurodegenerativas, así como orientar las intervenciones terapéuticas. La proyección de imagen basada en la fluorescencia permite la investigación de estos procesos complejos y dinámicos en las neuronas y ha contribuido enormemente a nuestra comprensión de la biología de la célula neuronal. Análisis de fluorescencia de etiquetado proteínas es un reto, sobre todo cuando los experimentos se llevan a cabo en vivo, altamente compacta los tejidos, tipos de células diversas y heterogeneidad morfológica. Cuantificación manual asistida es asequible y sencillo, pero es a menudo desperdiciadora de tiempo y sujeto a sesgo humano. Por lo tanto, hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes.
Hemos esbozado un flujo de trabajo simple y adaptable con Fiji/ImageJ, un software2,3, de procesamiento de imágenes poderosas y libremente accesibles para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes de fluorescencia en modelos experimentales de neurodegeneración con Drosophila. Siguiendo este protocolo para cuantificar la agregación proteica y autofagia flujo — dos celulares características biológicas que son altamente relevantes para la patología de enfermedades neurodegenerativas, demostró la sensibilidad y la reproducibilidad de este enfoque. Análisis de fluorescencia de etiquetado huntingtina (Htt) de proteínas en el lóbulo óptico de Drosophila revelaron el número, tamaño e intensidad de agregados de proteína. Visualizamos un reportero fluorescente del tándem de autofagia flujo dentro del sistema visual de Drosophila , que muestra señales de emisión diferentes dependiendo de la compartimentación medio ambiente4. Análisis del reportero tándem radiométrica permitió una visión cuantitativa y global del flujo de la autofagia-lisosoma de autophagosome formación, maduración y transporte a la degradación en el lisosoma y además destacó vulnerable compartimientos en enfermedades neurodegenerativas. Lo importante, en ambos análisis hemos implementado pasos umbralización y segmentación semiautomáticos en nuestro protocolo para minimizar el sesgo inconsciente, aumentar el poder de toma de muestras y proporcionar un estándar para facilitar las comparaciones entre estudios similares. El flujo de trabajo sencillo pretende hacer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desarrollado por científicos de la computación basados en algoritmos matemáticos) más accesible a los neurobiólogos y la comunidad de Ciencias de la vida en general.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí puede utilizarse para robusta y reproducible cuantificar procesos biológicos celulares visualizados por la proyección de imagen basada en fluorescencia. Contexto biológico y limitaciones técnicas necesitan ser cuidadosamente considerados para orientar el diseño experimental. Marcadores fluorescentes de estructuras subcelulares de interés, si immunohistochemical, teñir-basada, o genético expresado deben ser distinguibles sobre fondo de morfología e intensidad. El sistema de GAL4/UA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la Sheila y David Fuente neuropático dolor investigación programa de becas de pos-grado (a J.M.B.), los Lois Pope LIFE Fellows del programa (y C.L., Y.Z., J.M.B.), la Beca Predoctoral de la Fundación Robinson Snyder (a C.L.), el Dr. John T . Macdonald Fundación (C.L.), contratos, subvenciones de los institutos nacionales de salud (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 y R56NS095893 (a R.G.Z.) y proyecto de erudito de Taishan (provincia de Shandong, República Popular de China) (a R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
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