Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ
Summary
Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives d’études biologiques de fluorescence dotés d’imagerie cellulaire d’agrégation des protéines et du flux autophagie dans le système nerveux central de Drosophila modèles de neurodégénérescence.
Abstract
Avec l’augmentation de la prévalence des maladies neurodégénératives, c’est de plus en plus important de comprendre la physiopathologie sous-jacente qui mène à la perte et la dysfonction neuronale. Technologies et outils d’imagerie par fluorescence permettent une analyse inédite des processus neurobiologiques subcellulaires, mais il n’y a toujours un besoin d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie . Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives de basés sur la fluorescence des études d’imagerie utilisant des modèles de drosophile de la neurodégénérescence. Plus précisément, les auteurs décrivent une approche facile à suivre, semi-automatique à l’aide de Fidji/ImageJ pour analyser deux processus cellulaires : tout d’abord, nous quantifier la teneur totale en protéines et profil dans le lobe optique de drosophile à l’aide de mutant fluorescentes-tag protéines de la huntingtine ; et en second lieu, nous évaluons le flux de l’autophagie-lysosome dans le système visuel de drosophile avec quantification ratiométrique-basé d’un reporter fluorescent en tandem de l’autophagie. Ce qui est important, le protocole décrit ici comprend une étape de segmentation semi-automatique pour s’assurer que toutes les structures fluorescents sont analysées afin de minimiser les biais de sélection et d’augmenter la résolution des comparaisons subtiles. Cette approche peut être étendue pour l’analyse des autres structures biologiques cellulaires et processus impliqués dans la neurodégénérescence, tels que punctums protéiques (granules de stress et complexes synaptiques), compartiments ainsi que membranaires (mitochondries et trafic des vésicules membranaires). Cette méthode fournit un standard, pourtant référence adaptable point pour l’analyse d’images et de la quantification et pourrait faciliter la fiabilité et la reproductibilité dans le champ et finalement renforcer l’interprétation mécaniste de la neurodégénérescence.
Introduction
Maladies neurodégénératives touchent des millions de personnes chaque année et l’incidence augmente avec un vieillissement de la population1. Alors que chaque maladie neurodégénérative a une étiologie unique, agrégation de protéines mal repliées et ventilation du réseau protéostasie caractérisent commune pathologique d’un grand nombre de ces maladies. Élucider comment les perturbations de ces processus fondamentaux et interdépendants se dérègle pour contribuer à la mort neuronale de la dysfonction et de cellules est essentiel pour comprendre les maladies neurodégénératives, en plus de guider les interventions thérapeutiques. Imagerie par fluorescence permet l’étude de ces processus complexes et dynamiques dans les neurones et a grandement contribué à notre compréhension de la biologie cellulaire neuronale. L’analyse des protéines fluorescent étiquetés est un défi, particulièrement lorsque les expériences sont réalisées in vivo, en raison des tissus hautement compacts, types de diverses cellules et hétérogénéité morphologique. Quantification assistée manuellement est abordable et simple, mais il est souvent fastidieux et sous réserve de partialité humaine. Par conséquent, il y a une nécessité d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie.
Nous avons esquissé un workflow simple et adaptable à l’aide de Fidji/ImageJ, une image puissante et librement accessible, traitement logiciel2,3, pour extraire des données quantitatives d’études par imagerie de fluorescence sur des modèles expérimentaux de neurodégénérescence à l’aide de drosophile. En suivant ce protocole afin de quantifier l’agrégation des protéines et du flux autophagique — deux cellules caractéristiques biologiques qui sont très pertinents à la pathologie de la maladie neurodégénérative — nous avons démontré la sensibilité et la reproductibilité de cette démarche. Analyse des protéines fluorescent étiqueté de la huntingtine mutante (Htt) dans le lobe optique de drosophile a révélé le nombre, la taille et l’intensité des agrégats de protéine. Nous avons visualisé un journaliste fluorescent en tandem du flux autophagie dans le système visuel de drosophile , qui affiche des signaux d’émission différentes selon l’ environnement compartimenté4. Analyse comparative ratiométrique du reporter en tandem permettant une vision quantitative et globale du flux d’autophagie-lysosome de formation de l’autophagosome, la maturation et le transport à la dégradation dans le lysosome et a en outre souligné vulnérables compartiments perturbées dans les maladies neurodégénératives. Ce qui est important, dans les deux analyses, nous avons implémenté seuillage semi-automatisée et étapes de la segmentation dans notre protocole à minimiser le biais inconscient, augmenter la puissance de l’échantillonnage et fournir une norme pour faciliter les comparaisons entre des études similaires. Le flux de travail simple est destiné à rendre puissant plugins de Fidji/ImageJ (développés par des informaticiens basés sur des algorithmes mathématiques) plus accessibles aux neurobiologistes et la communauté des sciences de la vie en général.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici peut servir à solidement et de façon reproductible quantifier les processus biologiques cellulaires visualisées par l’imagerie par fluorescence. Contexte biologique et limitations techniques doivent être examinés attentivement pour guider la conception expérimentale. Marqueurs fluorescents des structures subcellulaires d’intérêt, si immunohistochimiques, teintée ou génétiquement ils sont exprimés, doivent être distinguables au-dessus de fond par la morphologie et l’intensité. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par la Sheila et David Fuente Neuropathic Pain Research Programme Graduate Fellowship (à J.M.B.), les Lois Pope LIFE Fellows Program (à C.L., Y.Z. et J.M.B.), la bourse prédoctorale de Snyder-Robinson Foundation (à C.L.), le Dr John T . La Fondation Macdonald (à C.L.), contrats, subventions du National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 et R56NS095893 (pour R.G.Z.) et par projet d’érudit Taishan (Province du Shandong, République populaire de Chine) (de R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
Referências
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. Genética. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
