혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수
Summary
여기, 우리는 설립된 셀 라인의 혐 기성 장기 재배를 가능 하 게 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 테스트는 최대의 생존 시간은 17 일 이다. 이 메서드는 세포 독성 대리인의 테스트 및 anoxically 세포 복제의 생리학 탐험에 적합 합니다.
Abstract
대부분 점 막 표면 종양에 줄기 세포 벽 중간점 함께 무산 소는 신체의 지리적 영역이 있습니다. 이전 연구 결과 부 화 normoxic (5% CO2 공기에서)에 또는 hypoxic (낮은 산소 수준) 조건 제한 가능성 (2-3 일)에 무산 소 인큐베이션 (자유로운 산소의 부재) 결과 옵니다. 새로운 방법론은 (적어도 17 일, 최대 시간 테스트)에 대 한 무산 소 세포 배양을 가능 하 게 개발 되었다. 이 방법론의 가장 중요 한 측면 산소 시스템에 도입 하는 것입니다. 이 기체 제거 미디어, 그리고 세 정 튜브, 요리, 플라스 크, 및 혐 기성 가스 혼합물 (H2, CO2, N2)와 함께 펫 자료 무산 소 (산소) 환경에 equilibrate를 허용 하 여 뒤에 의해 얻어진 다 이전에 사용. 현미경 얻은 아티팩트를 포함 하지 않도록 하려면 photomicrographs 인수 하는 경우 추가 관리를 행사 해야 합니다. 산소의 부재에서 셀 형태학 크게 변경 됩니다. 두 가지 morphotypes anaerobically 성장 하는 모든 셀에 대 한 설명 되어 있습니다. 성장 하 고 산소의 부재에 포유류 세포를 유지 하는 능력의 세포 생리학, polymicrobial 상호 작용, 그리고 소설 암 약물 개발에 대 한 생 합성 통로의 특성 분석에 적용할 수 있습니다.
Introduction
고체 종양, 줄기 세포 벽 감, 안 감 점 막 표면 세포 anoxia1,2,,34를 포함 하 여 감소 산소 수준, 경험 하는 환경에 존재 한다. 정상 생리 상태에서 산소 anoxia (산소의 완전 한 부재)5,6산소 보다 다릅니다. 대기 산소는 포유류 세포 복제에 부정적인 영향을 미치는 그 체 외에서 세포 성장이 고갈된 산소 조건에서 최적화 될 수 있습니다 실현 1970 년대 초반에 보고 되었다. 리히터 외. 7 1-3% 산소 수준 (hypoxia)의 대기 산소 (20%) 도금 효율 향상을 보여주었다. 인간 2 중 세포 수명 또한 hypoxic 문화 조건8에 확장 됩니다.
Vivo에서, hypoxic 조건이 발생할 때 산소 매장 고갈 (예를 들어를 강렬한 운동 동안)와 함께 발효 (혐 기성 호흡) 호 기성 호흡에서 골격 근육에 ATP 생산은 전환 하는 점에서 젖 산9의 최종 제품. 병 적, 암 종양, 내부에에서는 종양의 질량은 산소 가난한 vascularization 인해 무산 소를10. 종양 내부에 제한 된 관류의 효과 독립적으로 유효성을 검사 하지 종양 인테리어 의무 anaerobes1에 의해 식민지에 의해. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 알파 유전자의 표현에 전적으로 종속 hypoxia에서 종양 세포 생존은 생각 하는 mechanistically, (HIF1-알파), 산소4,11 초기 자발적인 응답은 , 12. HIF1-알파 hypoxic 조건 하에서 HIF1를 바인딩할 열 충격 단백질에 의해 유도 된다-알파 발기인 및 upregulate 유전자 전사12. 이 열 충격 단백질 종양 hypoxic microenvironment에서 본 다양 한 고기의 유도에 도움으로 추정 된다. 이 고기 세포 막 포도 당 운송업의 증가 표현과 분해 (바르 부르 크 효과)13의 속도 전시 한다. 결과 발효 젖이 나올를 미토 콘 드 리아 산화 인 산화에서 스위치입니다.
무산 소 생존 또한 대안 생존 현상14,15를 지원 하기 위해 포도 당을 활용할 수 있습니다. 최고의 공부 포유류입니다 두더지 쥐과 당 구동 glycolytic 발효 통로14통해 산소 없이 거의 20 분 동안 살아남을 수 있습니다. 특정 생선에 발생 하는 다른 적응 (예를 들어, 훨씬 더 이상 살아남을 수 있는 잉어 [떡 sp.], 기간 터미널 부산물로 에탄올 분해를 사용 하 여)15. 두 경우 모두, 발효 드라이브 활성화 산소의 부재에서 생존 하는 대사. 무산 소 생존에 대 한 현재 가설은 오랫동안으로 HIF1-알파16혐 기성 조건 발생 하는 산소에 대 한 필요 없이 hypoxia, 미토 콘 드리 아 호흡 하는 동안 활성화 됩니다. 또한, 그것은 가정 하는 hypoxic/무산 소 생존을 위한 발효 경로 사용 하 여 셀 셀 생존17에 해로운 증명할 수 있는 산화 스트레스 방지 이후 종양 생존을 향상. 이 공준 cardiomyocytes에서 hypoxia 종양 세포17에 배치 하는 산화 스트레스 감소를 보여주는 최근 연구에 의해 지원 됩니다.
날짜 하려면, 무산 소 포유류 세포 생존에 대 한 발효 통로의 본질은 되었습니다에 배어 든 문학, 인해, 3 일 이상 산소의 완전 한 부재에 문화 포유류 세포의 무 능력에 큰 부분에서. 그러나, 혐 기성 생존을 위한 분해 대신 박테리아에서 발생합니다. 특정 박테리아에 질소 또는 황산 (다른 화합물) 중 산소18시 토 크롬 산화 효소 시스템 부재에 대 한 터미널 전자 수락자로 사용할 수 있습니다. 세균과 진 핵 진화 마지막 보편적인 일반적인 조상에서 분기 이후 병렬로 발생, 비록 미토 콘 드리 아 1.542 백만 년 전에 바다19의 산소 세포에 에너지를 제공 했다 추정 된다 . 연구원은 고립 된 미토 콘 드리 아 터미널 전자 수락자로 아 질산염으로 산소의 부재에서 ATP를 생성할 수 있다 나타났습니다 그것 이므로 세포 산소의 부재에 3 일 이상 기간에 대 한 기능 수를 가정 하는 합리적 20 , 21 , 22 , 23.이 연구에서 설명 하는 방법론은 수많은 셀 라인의 혐 기성 포유류 세포 성장에 대 한 유틸리티.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 메서드는 산소의 부재에서 시간의 연장된 기간에 대 한 교양 했다 처음 포유류 세포를 나타냅니다. 현재 관측을 바탕으로는 무산 소 성장 기능을 통해 비 발효 통로 나타납니다 포유류 세포 라인28, 사이 보편적인 혐 기성 성장 형 분기에서 결과. 이 테스트는 모든 셀 라인에 대 한 관찰 되었다. 혐 기성 경작 셀의 비율을 증가 되었다 둥근, 서 스 펜 션 같은 인구 개발과 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 지원에 대 한 연구의 중서부 대학 사무실 및 후원 프로그램을 감사합니다.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
Referências
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