Anaerob vekst og vedlikehold av pattedyr cellelinjer
Summary
Her beskriver vi en ny metode som gjør at anaerobe langsiktige dyrking av etablerte linjer. Maksimal overlevelse tidspunktet ble testet er 17 dager. Denne metoden er egnet for testing av cytotoksiske agenter og utforske fysiologi av anoxically kopierer celler.
Abstract
Mest mucosal overflater med midtpunktene i svulster og stamcelleforskningen nisjer er geografiske områder av kroppen som er anoksisk. Tidligere studier viser at inkubasjon i normoxic (5% CO2 i luften) eller hypoxic (lav oksygen) forhold etterfulgt av en anoksisk inkubering (et fravær av fritt oksygen) resultater i begrenset levedyktighet (2-3 dager). En ny metode ble utviklet som gjør en anoksisk celle dyrking (for minst 17 dager, maksimal tid testet). Det viktigste aspektet ved denne metoden er å sikre at uten oksygen er innført i systemet. Dette oppnås med avgassing av media, og rødme rør, retter, flasker og Pipetter med en anaerob gassblanding (H2, CO2N2) etterfulgt av tillater materialet til equilibrate på anoksisk (ikke-oksygen)-miljøet før bruk. Ytterligere omsorg må utøves da anskaffe photomicrographs for å sikre at micrographs fikk ikke inneholder gjenstander. I fravær av oksygen endres betydelig celle morfologi. To forskjellige morphotypes er kjent for alle anaerob dyrket celler. Muligheten til å vokse og opprettholde pattedyrceller i fravær av oksygen kan brukes til analyse av cellen fysiologi og polymicrobial vekselsvirkningene karakterisering av biosyntetiske trasé for romanen kreft narkotika utvikling.
Introduction
Det finnes celler fra solide svulster, Stamcelle nisjer og de fôr mucosal overflater i miljøer som opplever reduserte oksygennivået, inkludert anoxia1,2,3,4. I normale fysiologiske stater varierer oksygenering enn av hypoksi anoxia (den komplette fraværet av oksygen)5,6. Realisering at atmosfærisk oksygen negativt påvirker pattedyr celle replikering og at i vitro cellevekst kan optimaliseres under utarmet oksygen forhold ble rapportert i 1970. Richter et al. 7 viste at 1-3% av oksygen (hypoksi) forbedret plating effektivitet sammenlignet med atmosfærisk oksygen (20%). Human diploide celle levetiden er også utvidet i hypoxic kultur forhold8.
I vivo, hypoxic forhold oppstår når oksygen butikker er oppbrukt (f.eksunder intens trening), der ATP produksjonen er slått i skjelettmuskulatur fra aerobic åndedrett til gjæring (bruke karbohydrater respirasjon) med den sluttproduktet av melkesyre9. Patologisk, i kreftsvulster, interiøret av svulsten er hypoxic til anoksisk på grunn av dårlig endometrial blodkar10. Effekten av den begrensede perfusjonen på svulst interiør valideres uavhengig av svulst interiør kolonisert av forplikte anaerobes1. Mechanistically, svulst celle overlevelse i hypoksi antas å være utelukkende avhengig uttrykket av hypoksi-induserbart faktor 1 alfa-genet (HIF1-alfa), som er første spontane reaksjon hypoksi4,11 , 12. HIF1-alpha er indusert under hypoxic forhold av varme sjokk proteiner som binder HIF1-alpha arrangøren og upregulate gene transkripsjon12. Disse varme sjokk proteinene antas å hjelpe induksjon av de ulike fenotyper i svulst hypoxic microenvironment. Disse fenotyper utstilling det økt uttrykket for cellemembranen glukose transportører og frekvensen av Glykolysen (Warburg effekt)13. Resultatet er en bryter fra Mitokondrielt oxidative fosforylering til laktat gjæring.
Anoksisk overlevelse kan også bruke alternativer til glukose for å støtte den overlevelse fenomen14,15. Det best studerte pattedyr eksemplet er mole rotte, som kan overleve i nesten 20 minutter uten oksygen gjennom en fruktose-drevet glycolytic gjæring veien14. En alternativ tilpasning oppstår i enkelte fisk (f.ekskarpe [Carassius sp.], som kan overleve for betydelig lenger tid perioder med Glykolysen med etanol som terminal biprodukt)15. I begge tilfeller stasjoner gjæring stoffskiftet slik at overlevelse i fravær av oksygen. Gjeldende hypotesen for anoksisk overlevelse er at så lenge HIF1-alpha blir aktivert hypoksi, mitokondrie åndedrett, uten behov for oksygen, oppstår under anaerobe forholdene16. Videre er det postulerte at bruk av en fermentative sti for hypoxic/anoksisk overlevelse forbedrer svulst overlevelse siden cellene unngå oksidativt stress som kan vise seg for å være skadelig for cellen overlevelse17. Denne postulatet støttes av en fersk studie som viser at i cardiomyocytes, hypoksi reduserer oksidativt stress på svulst celle17.
Hittil er vesentlig vesen en fermentative sti for anoksisk pattedyr celle overlevelse inngrodd i litteraturen, grunn, i stor grad, en manglende evne til å kultur pattedyrceller i den komplette fraværet av oksygen i mer enn 3 dager. Et alternativ til Glykolysen for anaerob overlevelsen skjer imidlertid i bakterier. I visse bakterier, kan nitrogen eller sulfate (blant andre forbindelser) tjene som terminal elektron acceptors på cytochrome oxidase systemet i fravær av oksygen18. Selv om bakteriell og eukaryotic utviklingen skjedde i parallell siden avviker fra siste universell felles stamfar, er det anslått at mitokondrier var å gi energi til celler for 1.542 millioner år før oksygenering av havene19 . Siden forskere har vist at kan de isolerte mitokondriene produserer ATP i fravær av oksygen, med nitritt som terminal elektron acceptor, er det rimelig å anta at cellene kan fungere for perioder lengre enn 3 dager i fravær av oksygen 20 , 21 , 22 , 23. metodikk beskrevet i denne studien har et verktøy for anaerob pattedyr cellevekst i mange linjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metoden representerer første gang pattedyrceller som ble kultivert for lengre perioder i fravær av oksygen. Basert på dagens observasjoner, synes den anoksisk vekst evne via en ikke-fermentative sti å være universell blant pattedyrceller linjer28, hvor den anaerob veksten resulterte i fenotypen divergens. Dette ble observert for alle linjer testet. Med det anaerob dyrking, øke andelen cellene ble avrundet, utviklet en suspensjon som befolkning, og klarte å gjenskape. Sekundæ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Midwestern University Office for forskning og støttede programmer for deres støtte.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
Referências
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
