Anaerobe Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien
Summary
Hier beschreiben wir eine neue Methode, die den anaeroben langfristige Anbau von etablierten Zelllinien ermöglicht. Die maximale Überlebenszeit, die getestet wurde ist 17 Tage. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von Zytostatika und Erforschung der Physiologie der anoxically Zellen repliziert.
Abstract
Die meisten Schleimhaut-Oberflächen zusammen mit den Mittelpunkten in Tumoren und Stammzell-Nischen sind geographische Bereiche des Körpers, die anoxischen sind. Bisherige Studien zeigen, dass die Inkubation in Inklusieve (5 % CO2 in Luft) oder hypoxischen Bedingungen (niedrige Sauerstoffniveaus) gefolgt von einer anoxischen Inkubation (fehlender freier Sauerstoff) Ergebnisse in begrenzte Lebensfähigkeit (2 – 3 Tage). Eine neuartige Methode wurde entwickelt, eine anoxische Zellkultivierung (für mindestens 17 Tage, die maximale Zeit getestet). Der wichtigste Aspekt dieser Methodik soll sicherstellen, dass kein Sauerstoff in das System eingeführt wird. Dies ergibt sich durch das Ausgasen von Medien und durch Spülung Röhren, Gerichte, Fläschchen und Pipetten mit einem anaeroben Gasgemisch (H2, CO2, N2) gefolgt von schönem zu equilibrate der anoxischen (Sauerstoff) Umwelt Materialien vor dem Gebrauch. Zusätzliche Sorgfalt muss beim Erwerb von Mikrofotos um sicherzustellen, dass die Aufnahmen erhalten keine Artefakte enthalten. In Abwesenheit von Sauerstoff ist Zellmorphologie erheblich verändert. Zwei unterschiedliche morphotypen sind für alle anaerob wachsen Zellen festgestellt. Die Fähigkeit zu wachsen und zu pflegen Säugerzellen in Abwesenheit von Sauerstoff kann zur Analyse der Zellphysiologie, Biofilm-Interaktionen und die Charakterisierung von biosynthetischen Bahnen für neuartige Wirkstoffforschung angewendet werden.
Introduction
Zellen von soliden Tumoren, Stammzell-Nischen und die Auskleidung der Schleimhaut-Oberflächen gibt es in Umgebungen, in denen geringere Sauerstoffgehalt, darunter Anoxie1,2,3,4erleben. In normalen physiologischen Staaten variiert Sauerstoffversorgung jenseits der Hypoxie, Sauerstoffmangel (das völlige Fehlen von Sauerstoff)5,6. Die Erkenntnis, dass Luftsauerstoff säugerzelle Replikation beeinträchtigt und das Zellwachstum in-vitro- Bedingungen abgereichertem Sauerstoff optimiert werden kann wurde in den frühen 1970er Jahren berichtet. Richter Et al. 7 zeigten, dass 1 – 3 % der Sauerstoffsättigung (Hypoxie) Beschichtung gegenüber Luftsauerstoff (20 %) gesteigert. Die menschliche diploide Zelle Lebensdauer ist auch in der Kultur hypoxischen Bedingungen8verlängert.
In Vivo, hypoxische Bedingungen auftreten, wenn Sauerstoff speichert abgereichertem (z. B.bei intensivem Training), wobei die ATP-Produktion in der Skelettmuskulatur von Atmung auf Gärung (anaerobe Atmung) mit ausgeschaltetem der Endprodukt Milchsäure-9. Pathologisch, in Krebstumoren, das Innere des Tumors Masse ist, aufgrund der schlechten Vaskularisation anoxischen hypoxischen10. Die Wirkung der begrenzten Durchblutung auf Tumor Innenräume wird unabhängig vom Tumor Innenräume kolonisiert durch obligat Anaerobier1überprüft. Mechanistisch, Tumor Zelle Überleben in Hypoxie wird angenommen, dass die Expression des Gens Hypoxie-induzierbare Faktor 1-Alpha allein abhängig (HIF1-Alpha), das ist die erste spontane Reaktion auf Hypoxie4,11 , 12. HIF1-Alpha wird durch HITZESCHOCKPROTEINE, die HIF1binden unter hypoxischen Bedingungen induziert-alpha Promoter und Upregulate gen Transkription12. Diese HITZESCHOCKPROTEINE werden geglaubt, um die Induktion der verschiedenen Phänotypen gesehen in den Tumor hypoxischen Mikroumgebung zu unterstützen. Diese Phänotypen weisen einen erhöhten Ausdruck der Zellmembran Glukose-Transporter und die Rate der Glykolyse (Warburg-Effekt)13. Das Ergebnis ist ein Wechsel von Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung zu Laktat-Gärung.
Anoxischen überleben kann auch Alternativen zu Glukose zu überleben Phänomen14,15Unterstützung nutzen. Die untersuchte Säugetiere Beispiel ist der Maulwurf Ratte, die für fast 20 Minuten ohne Sauerstoff durch eine Fruktose-driven glykolytischen Gärung Weg14überleben können. Eine alternative Anpassung tritt in bestimmten Fisch (z.B.Karpfen [Carassius SP.], die deutlich länger überleben können Zeiträume mit Glykolyse mit Ethanol als das terminal Nebenprodukt)15. In beiden Fällen treibt die Gärung den Stoffwechsel, so dass das Überleben in der Abwesenheit von Sauerstoff. Die aktuelle Hypothese anoxischen überlebenswichtig ist, dass so lange als HIF1-Alpha ist bei Hypoxie, mitochondriale Atmung aktiviert, ohne die Notwendigkeit für Sauerstoff, tritt unter anaeroben Bedingungen16. Darüber hinaus wird postuliert, dass die Verwendung von fermentative Weg für hypoxische/anoxischen überleben Tumor überleben verbessert, da die Zellen oxidativen Stress, die könnte vermeiden sich nachteilig auf die Zelle überleben17. Dieses Postulat wird unterstützt durch eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt, dass in Kardiomyozyten, Hypoxie den oxidativen Stress auf den Tumor Zelle17platziert senkt.
Bis heute hat die essentielle Natur eines fermentative Signalwegs für anoxischen Säugetier-Zelle Überleben in der Literatur, im großen Teil auf die Unfähigkeit, Kultur Säugerzellen in das völlige Fehlen von Sauerstoff für mehr als 3 Tage schon tief verwurzelt. Allerdings tritt eine Alternative zum Überlebenskampf der anaeroben Glykolyse in Bakterien. In bestimmten Bakterien dient Stickstoff oder Sulfat (unter anderen Verbindungen) als terminal Elektronen Akzeptoren für das Cytochrom-Oxidase-System in der Abwesenheit von Sauerstoff-18. Obwohl die bakterielle und Eukaryotische Evolution parallel seit der letzte universelle gemeinsame Vorfahr abweichende aufgetreten, wird geschätzt, dass Mitochondrien Energie Zellen 1,542 Millionen Jahre bevor die Sauerstoffversorgung der Ozeane19 bereitstellten . Da Forscher haben gezeigt, dass die isolierte Mitochondrien ATP in der Abwesenheit von Sauerstoff zu Nitrit als das terminal Elektron Akzeptor produzieren können, ist es vernünftig anzunehmen, dass Zellen über einen Zeitraum länger als 3 Tage in der Abwesenheit von Sauerstoff funktionieren könnte 20 , 21 , 22 , 23. in dieser Studie beschriebene Methode hat ein Dienstprogramm für die anaerobe Säugetier-Zelle Wachstum von zahlreichen Zelllinien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode stellt erstmals Säugetier-Zellen, die für längere Zeit in Abwesenheit von Sauerstoff gezüchtet wurden. Basierend auf aktuellen Beobachtungen, scheint der anoxischen Wachstum Fähigkeit über einen nicht fermentative Weg universal unter Säugerzellen Linien28, wo führte die anaerobe Wachstum Phänotyp Divergenz. Dies war für alle Zelllinien getestet beobachtet. Mit dem anaeroben Anbau wachsenden Ausmaßes der Zellen wurde abgerundet, entwickelt eine Aussetzung-wie Bevö…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Midwestern University Office of Research und geförderte Programme für ihre Unterstützung.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
Referências
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