Crescita anaerobica e la manutenzione di linee cellulari di mammifero
Summary
Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente la coltivazione anaerobica a lungo termine di linee cellulari stabilizzate. Il tempo di sopravvivenza massima che è stato testato è di 17 giorni. Questo metodo è adatto per la sperimentazione di agenti citotossici ed esplorare la fisiologia di replicare anoxically cellule.
Abstract
Più superfici mucose insieme i punti medi in tumori e nicchie staminali sono aree geografiche del corpo che sono anossiche. Gli studi precedenti indicano che l’incubazione in condizioni di normossia (5% CO2 nell’aria) o hypoxic condizioni (bassi livelli di ossigeno) seguirono da un risultati di incubazione anossico (un’assenza di ossigeno libero) nell’attuabilità limitato (2 – 3 giorni). Una nuova metodologia è stata sviluppata che consente una coltura cellulare anossica (per almeno 17 giorni; il tempo massimo testato). L’aspetto più critico di questa metodologia è quello di garantire che nessun ossigeno è stato introdotto nel sistema. Ciò si ottiene il degassamento dei media e di lavaggio tubi, piatti, boccette e le pipette con una miscela di gas anaerobico (H2, CO2, N2) seguita da permettendo i materiali per equilibrare l’ambiente anossico (non-ossigeno) prima dell’uso. Maggiore cura deve essere esercitato quando l’acquisizione di microfotografie per garantire che le micrografie ottenute non contengono artefatti. In assenza di ossigeno, la morfologia delle cellule è alterata significativamente. Due morfotipi distinti sono noti per tutte le cellule coltivate in condizioni aerobiche. La capacità di crescere e mantenere le cellule di mammiferi in assenza di ossigeno può essere applicata all’analisi della fisiologia cellulare, interazioni polimicrobica e la caratterizzazione delle vie biosintetiche per lo sviluppo di farmaci innovarici del cancro.
Introduction
Le cellule dai tumori solidi, nicchie di cellule staminali e quelle rivestimento superfici mucose presenti in ambienti che sperimentano livelli di ossigeno ridotto, tra cui anossia1,2,3,4. In condizioni fisiologiche normali, ossigenazione varia oltre quello di ipossia per anossia (la completa assenza di ossigeno)5,6. La realizzazione che ossigeno atmosferico influisce negativamente sulla replica delle cellule dei mammiferi e tale crescita in vitro delle cellule può essere ottimizzata in condizioni impoverito di ossigeno è stata segnalata nei primi anni 1970. Richter et al. 7 ha mostrato che 1 – 3% dei livelli di ossigeno (ipossia) migliorare l’efficienza della placcatura rispetto ad ossigeno atmosferico (20%). La durata della vita umana cellula diploide è esteso anche in condizioni ipossiche cultura8.
In vivo, condizioni di ipossia si verificano quando i negozi di ossigeno sono impoverito (ad es., durante l’esercizio intenso), in cui la produzione di ATP è inserita nel muscolo scheletrico da respirazione aerobica alla fermentazione (respirazione anaerobica) con la prodotto finale di acido lattico9. Patologico, in tumori cancerosi, all’interno del tumore massa è ipossica a anossico a causa della scarsa vascolarizzazione10. L’effetto della perfusione limitata all’interno del tumore viene convalidato indipendentemente da interni di tumore colonizzati da anaerobi1. Meccanicistico, sopravvivenza delle cellule del tumore nell’ipossia è pensata per essere dipendente unicamente sull’espressione del gene di 1 alfa fattore ipossia-inducibile (HIF1-alfa), che è la prima risposta spontanea alla ipossia4,11 , 12. HIF1-alfa è indotta in condizioni di ipossia da proteine dello shock termico che legano il HIF1-alfa promotore e aumentano la trascrizione genica12. Si ritiene che queste proteine di scossa di calore aiuto nell’induzione dei vari fenotipi visto nel microambiente tumorale ipossica. Questi fenotipi mostrano un incremento dell’espressione dei trasportatori del glucosio della membrana cellulare e il tasso di glicolisi (l’effetto Warburg)13. Il risultato è un interruttore da fosforilazione ossidativa mitocondriale di lattato fermentazione.
Anossico sopravvivenza possa anche utilizzare delle alternative a glucosio per sostenere la sopravvivenza fenomeno14,15. Il miglior esempio di mammiferi studiato è il Ratto talpa, che possono sopravvivere per quasi 20 minuti senza ossigeno attraverso una fermentazione glicolitico fruttosio-driven via14. Un adattamento alternativo si verifica in alcuni pesci (ad es., carpa [Carassius SP.], che possa sopravvivere per significativamente più lungamente periodi utilizzando glicolisi con etanolo come il sottoprodotto terminale di tempo)15. In entrambi i casi, fermentazione unità il metabolismo consentendo la sopravvivenza in assenza di ossigeno. L’ipotesi corrente per la sopravvivenza anossico è che così a lungo come HIF1-alfa è attivato durante l’ipossia, la respirazione mitocondriale, senza la necessità di ossigeno, si verifica in condizioni anaerobiche16. Inoltre, è postulato che l’uso di una via fermentativa per sopravvivenza ipossico/anossico migliora la sopravvivenza del tumore dal momento che le cellule evitare stress ossidativo che potrebbe rivelarsi dannosa per la sopravvivenza delle cellule17. Questo postulato è supportato da uno studio recente che mostra che in cardiomiociti, ipossia riduce lo stress ossidativo collocato sul tumore cella17.
Fin qui, la natura essenziale di una via fermentativa per la sopravvivenza della cellula di mammiferi anossico è stata radicata nella letteratura, dovute, in gran parte, ad un’incapacità di cellule di mammifero di cultura in completa assenza di ossigeno per più di 3 giorni. Tuttavia, un’alternativa alla glicolisi per la sopravvivenza anaerobica si verifica nei batteri. In alcuni batteri, azoto o solfato (tra altri composti) può servire come accettori terminali per il sistema del citocromo ossidasi in assenza di ossigeno18. Sebbene l’evoluzione batterica ed eucariotica è avvenuta in parallelo dal divergenti dall’ultimo antenato comune universale, si stima che i mitocondri sono state fornendo energia alle cellule per 1,542 milioni anni prima l’ossigenazione degli oceani19 . Poiché i ricercatori hanno indicato che i mitocondri isolati possono produrre ATP in assenza di ossigeno, con nitrito come accettore terminale di elettroni, è ragionevole supporre che le cellule potrebbero funzionare per periodi di tempo più lungo di 3 giorni in assenza di ossigeno 20 , 21 , 22 , 23. la metodologia descritta in questo studio è un programma di utilità per la crescita di cellule di mammifero anaerobica di numerose linee cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo rappresenta la prima volta le cellule di mammiferi che sono state coltivate per lunghi periodi di tempo in assenza di ossigeno. Sulla base di osservazioni attuale la crescita anossico capacità tramite una via non-fermentativo sembra essere universale tra le cellule di mammiferi linee28, dove la crescita anaerobica ha provocato la divergenza di fenotipo. Questo è stato osservato per tutte le linee cellulari testate. Con la coltura anaerobica, aumentando le proporzioni delle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Midwestern University ufficio di ricerca e programmi sponsorizzati per il loro sostegno.
Materials
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
Referências
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?. Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
