Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Summary

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs) sono in continua valutazione per migliorare i risultati e ridurre i rischi associati. Questo manoscritto descrive una procedura di trasferimento dell’embrione minimamente invasiva con un efficiente protocollo di crioconservazione che consente l’uso di conigli come modello animale ideale di riproduzione umana.

Abstract

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs), come la coltura embrionale in vitro o la crioconservazione degli embrioni, influenzano i modelli di sviluppo naturale con conseguenze perinatale e postnatale. Per garantire l’innocuità delle applicazioni ART, sono necessari studi su modelli animali. Inoltre, come ultimo passo, gli studi sullo sviluppo degli embrioni richiedono una valutazione della loro capacità di sviluppare una progenie sana a lungo termine. Qui, il trasferimento dell’embrione nell’utero è indispensabile per eseguire qualsiasi esperimento correlato alle arti.

Il coniglio è stato usato come organismo modello per studiare la riproduzione dei mammiferi per oltre un secolo. Oltre alla sua vicinanza filogenetica alla specie umana e alle sue piccole dimensioni e ai bassi costi di manutenzione, ha importanti caratteristiche riproduttive come l’ovulazione indotta, una cronologia dello sviluppo embrionale precoce simile all’uomo e una breve gestazione che ci permettono di studiare facilmente le conseguenze dell’applicazione ART. Inoltre, le arti (come l’iniezione intracitoplasmatica dello sperma, la coltura embrionale o la crioconservazione) vengono applicate con un’adeguata efficienza in questa specie.

Utilizzando la tecnica di trasferimento dell’embrione laparoscopica e il protocollo di crioconservazione presentato in questo articolo, descriviamo 1) come trasferire gli embrioni attraverso una tecnica facile, minimamente invasiva e 2) un protocollo efficace per lo stoccaggio a lungo termine di coniglio per fornire capacità logistiche flessibili nel tempo e la capacità di trasportare il campione. I risultati ottenuti dopo il trasferimento di embrioni di coniglio in diverse fasi evolutive indicano che la morula è la fase ideale per il recupero e il trasferimento degli embrioni di coniglio. Pertanto, è necessario un trasferimento di embrioni oviductal, giustificando la procedura chirurgica. Inoltre, le morule di coniglio sono con successo vetrificata e laparoscopicamente trasferite, dimostrando l’efficacia delle tecniche descritte.

Introduction

Con l’obiettivo di bypassare l’infertilità umana o migliorare la diffusione del bestiame di alto valore genetico e preservare le risorse genetiche animali, una serie di tecniche denominate collettivamente tecnologie di riproduzione assistita, come la superovulazione, de fecondazione in vitro, coltura embrionale, o crioconservazione, sono stati sviluppati^1,2. Attualmente, vengono somministrati trattamenti ormonali per stimolare le ovaie e produrre un gran numero di follicoli ovarici antrici¹. Gli ovociti raccolti da questi follicoli possono essere maturati, fertilizzati e sviluppati in vitro fino a quando non sono criopriservati o trasferiti alle madri surrogato³. Tuttavia, durante questi trattamenti, gameti e zigoti sono esposti a una serie di processi non fisiologici che potrebbero richiedere l’adattamento dell’embrione per sopravvivere in queste condizioni^4,5. Questo adattamento è possibile a causa della plasticità embrionale precoce, che consente cambiamenti embrionali nell’espressione genica e nella programmazione dello sviluppo⁶. Tuttavia, queste modifiche possono influenzare le fasi successive dello sviluppo embrionale fino all’età adulta, ed è ora ampiamente accettata che metodi, tempi, procedure di crioconservazione o condizioni di coltura mostrano risultati diversi sul destino dell’embrione^{7 , 8}. Pertanto, per chiarire gli effetti specifici indotti delle arti, l’uso di modelli animali ben caratterizzati è inevitabile.

La prima nascita documentata dal vivo risultante dal trasferimento di embrioni di mammiferi ha avuto luogo nel 1890⁹. Oggi, il trasferimento di embrioni (ET) a una femmina surrogata è un passo cruciale nello studio degli effetti indotti dall’arte durante il preimpianto nelle successive fasi di sviluppo dell’embrione¹⁰. Le tecniche ET dipendono dalle dimensioni e dalla struttura anatomica di ogni animale. Nel caso di modelli animali di grandi dimensioni, è stato possibile eseguire ET con tecniche di ET non chirurgiche transcervicali, ma in specie di dimensioni più ridotte la cateterizzazione della cervice è più complessa e le tecniche chirurgiche sono frequentemente utilizzate¹¹. Tuttavia, l’ET chirurgico può causare emorragie che potrebbero compromettere lo sviluppo dell’impianto e dell’embrione, poiché il sangue può invadere il lume uterino, causando la morte embrionale¹⁰. Le tecniche di et non chirurgiche transcervicali sono ancora applicate in esseri umani, babooni, bovini, suini e topi^{12,13,14,15,16,17}, ma chirurgico Gli ETS sono ancora utilizzati in specie come capre, ovini o altri animali che presentano ulteriori difficoltà^{10,18,19,20,21}, come i conigli (due indipendenti) o topi (di piccole dimensioni). Tuttavia, i metodi di trasferimento chirurgico tendono ad essere gradualmente sostituiti da metodi meno invasivi. L’endoscopia è stata utilizzata per trasferire embrioni, ad esempio, in conigli, suini e piccoli ruminanti^18,19,20. Questi metodi endoscopici minimamente invasivi possono essere utilizzati per trasferire embrioni nell’Anulla attraverso l’infundibulum, che è essenziale nei conigli e ha dimostrato effetti benefici in alcune specie²⁰. Ciò si basa sull’importanza del corretto dialogo tra embrione e madre durante i primi stadi embrionali nell’ovidotto. Come accennato in precedenza, il rimodellamento embrionale che si svolge nei conigli durante la migrazione embrionale attraverso l’ovidotto è essenziale per ottenere embrioni in grado di impiantare^22,23.

Modelli animali di dimensioni maggiori, come i bovini, sono interessanti perché le caratteristiche biochimiche e preimpiantanti sono simili a quelle della specie umana²⁴. Tuttavia, gli animali di grandi dimensioni sono troppo costosi da usare nelle prove preliminari, e i roditori sono considerati un modello ideale (76 gli organismi modello% sono roditori) per la ricerca di laboratorio²⁵. Tuttavia, il modello di coniglio fornisce alcuni vantaggi rispetto ai roditori negli studi sulla riproduzione, poiché alcuni processi biologici riproduttivi esposti dagli esseri umani sono più simili nei conigli rispetto a quelli nei topi. L’uomo e i conigli presentano un’attivazione del genoma embrionale cronologico simile, la gastrulazione e la struttura della placenta hemochorial. Inoltre, utilizzando conigli è possibile conoscere l’esatta tempistica di fecondazione e fasi di gravidanza a causa della loro ovulazione indotta²⁵. I cicli di vita dei conigli sono brevi, completando la gestazione in 31 giorni e raggiungendo la pubertà a circa 4-5 mesi; l’animale è facile da maneggiare grazie al suo comportamento docile e non aggressivo, e il suo mantenimento è molto economico rispetto alle spese degli animali più grandi. Inoltre, è fondamentale ricordare che i conigli hanno un utero duplex con due cervidi indipendenti^11,25. Questo colloca il coniglio in una posizione preferenziale, poiché gli embrioni provenienti dai diversi gruppi sperimentali possono essere trasferiti nello stesso animale, ma in un altro corno uterino. Questo ci permette di confrontare entrambi gli effetti sperimentali, riducendo il fattore materno dai risultati.

Oggi, i metodi ET non chirurgici non sono in uso nel coniglio. Alcuni studi condotti alla fine degli anni ’90 utilizzando una tecnica transcervicale hanno portato a bassi tassi di consegna che vanno da 5,5% a 20,0%^11,26 contro 50-65% con metodi chirurgici, tra cui la procedura di laparoscopia descritta da Besenfelder e Brem¹⁸. I bassi tassi di successo di questi metodi ET non chirurgici nei conigli coincidono con la mancanza del necessario rimodellamento dell’embrione nell’ovidotto, che viene evitato nell’ET transcervicale. Qui, descriviamo un’efficace procedura laparoscopica ET minimamente invasiva utilizzando conigli come organismo modello. Questa tecnica fornisce un modello per ulteriori ricerche sulla riproduzione in animali di grandi dimensioni e umani.

Poiché i conigli hanno una finestra temporale particolarmente ristretta per l’impianto embrionale, l’ET in questa specie richiede un alto grado di sincronia tra la fase evolutiva dell’embrione all’ET e lo stato fisiologico del ricevente²⁷. In alcuni casi, dopo un trattamento riproduttivo che rallenta lo sviluppo dell’embrione (come la coltura in vitro ) o altera la ricettività endometriale (come i trattamenti di superovulazione), non vi è alcuna sincronia tra l’embrione e l’utero materno. Queste situazioni possono influire negativamente sui risultati. Per rispondere in questi contesti, descriviamo un efficace protocollo di vitrificazione del coniglio morula che ci permette di mettere in pausa, organizzare e riprendere gli esperimenti. Questo processo è logisticamente auspicabile per gli studi sulla riproduzione e ci dà la capacità di stoccaggio a lungo termine di embrioni, permettendo il loro trasporto. La procedura laparoscopica e le strategie di criopriservazione consentono una migliore pianificazione degli studi con meno animali. Così, la nostra metodologia offre vantaggi igienici ed economici ed è conforme al concetto di 3Rs (sostituzione, riduzione e perfezionamento) della ricerca animale con l’obiettivo dichiarato di migliorare il trattamento umano degli animali da esperimento. Così, con questi metodi, i conigli costituiscono un organismo modello ideale per saggi riproduttivi in vivo .

Protocol

Tutte le procedure sperimentali utilizzate in questo studio sono state eseguite in conformità alla direttiva 2010/63/UE CEE per gli esperimenti sugli animali e riviste e approvate dal comitato etico per la sperimentazione con gli animali dell’Universitat Politècnica de València, Spagna (codice di ricerca: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC e JSV detiene un certificato di autorizzazione emesso dall’amministrazione governativa Valenciana per sperimentare sugli animali. XGD è autorizzata a sorvegliare in situ il beness…

Representative Results

Il trasferimento laparoscopico minimamente invasivo di embrioni freschi o vetrificati pone il coniglio tra i migliori modelli di animali per gli studi riproduttivi. La tabella 1 Mostra i risultati dell’et fresco in diverse fasi evolutive (Figura 4) degli embrioni trasferiti. Il tasso di sopravvivenza alla nascita (percentuale di embrioni risultanti in un cucciolo) ha dimostrato l’efficacia della tecnica laparoscopica descritta in questo docum…

Discussion

Dal primo caso documentato di nascita dal vivo degli embrioni trasferiti⁹, questa tecnica e le specie di coniglio sono diventate cruciali negli studi sulla riproduzione. Inoltre, gli studi di ricerca sull’embrione che coinvolgono manipolazione, produzione, crioconservazione, ecc. richiedono come ultimo passo la valutazione della capacità embrionale per generare una progenie sana a pieno termine. Pertanto, la tecnica di trasferimento degli embrioni è indispensabile^13</s…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	332
Buprenorphine hydrochloride	Alvet Escartí	626	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate	Sigma Aldrich	B3303
Clorhexidine digluconate soap	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution	Alvet Escartí	0265DCCA500B
CO2	Air Liquide	99921	CO2 N48.
CO2 Incubator	Fisher scientific	15385194
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Without calcium chloride.
Electric razor	Oster Golden A5	078005-140-002
Endoscope camera	Optomic Spain S.A	OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Lightweight trocar model.
Enrofloxacin	Alvet Escartí	9993046	To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G	Alvet Escartí	514056353	Smaller needles can be also used.
Epidural catheter	Vygon corporate	187.10
Epidural needle	Vygon corporate	187.10
Ethylene Glycol	Sigma Aldrich	102466-M
Eye ointment	Alvet Escartí	5273
Ketamine hydrochloride	Alvet Escartí	184	To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
Liquid Nitrogen	Air Liquide	P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Meloxicam	Alvet Escartí	9993501	To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm	Sigma Aldrich	CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan)	IBOR medica	7140028
Plastic Straw 0.25 mL	IMV – technologies	6431
Povidone iodide solution	Alvet Escartí	02656DPYS500S
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Stereomicroscope	Leica	MZ16F	There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves	Alvet Escartí	087GL010075
Sterile gown	Alvet Escartí	12261501
Sterile mask	Alvet Escartí	058B15924B
Straw Plug	IMV – technologies	6431
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Syringe, 1-mL	Fisher scientific	11750425
Syringe, 5-mL	Fisher scientific	11773313
Urinary catheter	IMV – technologies	17722
Waterbath	RAYPA	BAE-4
Xylazine	Alvet Escartí	525225	To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits	Universitat Politècnica de València	Line A	Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.