Indarbejde en cyclopropene derivat af lysin i antistoffer tillader den lokationsspecifikke, hurtige og effektiv kobling af tetrazine-bærende molekyler til at generere antistof-drug konjugater.
Antistof-drug konjugater (ADCs) anvendes i dag i klinisk praksis er blandinger af antistof molekyler knyttet til et varierende antal toksiner på forskellige positioner. Prækliniske undersøgelser har vist, at det terapeutiske indeks af disse traditionelle ADCs kan forbedres ved en lokationsspecifik sammenkædning af toksiner. Nuværende metoder til at producere homogene ADCs har dog flere begrænsninger, såsom lavt proteinindhold udtryk og langsom reaktion kinetik. I denne protokol beskriver vi, hvordan du opretter et udtryk til at medtage en cyclopropene derivat af lysin (CypK) i antistoffer ved hjælp af genetiske kode ekspansion. Denne minimale bioorthogonal håndtag giver mulighed for hurtig konjugering af tetrazine derivater gennem en invers-demand Diels-elletræ cycloaddition. Udtrykket systemet her rapporteret muliggør facile produktion og rensning af trastuzumab forsynet med CypK i hver af de tunge kæder. Vi forklare, hvordan at linke antistoffet til toksin mellem auristatin E og karakterisere immunoconjugate af hydrofobe interaktion kromatografi og massespektrometri. Endelig vil beskrive vi assays til at vurdere stabiliteten i humant serum af dihydropyridazine koblingen som følge af konjugering og teste den selektive cytotoksicitet af ADC for brystkræftceller med høje niveauer af HER2-receptoren.
Antistof-drug konjugater (ADCs) kombinere af biotherapeutics selektivitet og styrken af små cytotoksiske molekyler. De fleste ADCs har til formål at mindske bivirkninger af traditionel kemoterapi ved at målrette medicin, der påvirker DNA eller mikrotubulus polymerisering til kræft celler1. Første generations ADCs godkendt af Food and Drug Administration (FDA) stole om ændring af lysines og cysteines, som genererer blandinger af molekyler ændret på forskellige positioner med nedsat farmakokinetiske egenskaber2. Derimod kan lokationsspecifikke konjugation af narkotika til antistofferne generere forbindelser med forbedret terapeutiske indeces3,4. Søger at løse producerer homogene ADCs, har flere selektive kemiske og enzymatiske ændringer været rapporteret1,5. Men nuværende metoder kan målrette kun bestemte holdning på antistoffet, lider af lavt proteinindhold udtryk, giver linkers med lav stabilitet, eller stole på langsomme og lav-eftergivende reaktioner.
Inddragelsen af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA) gennem genetiske kode udvidelse muliggør lokationsspecifikke installation af en overflod af bioorthogonal reaktive grupper i proteiner, potentielt at overvinde begrænsningerne af andre metoder, der anvendes til at generere ADCs. Kodning ncAAs svar på en target (stop) codon er afhængig af aminoacyl-tRNA syntetase/tRNA-par, der er ortogonale i forhold til de endogene par, at indarbejde kanoniske aminosyrer6. Flere ncAAs er blevet indarbejdet i antistoffer til at generere ADCs. Dog mest lider forskellige forpligtelser for applikationer i terapeutiske drug konjugering. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 er ikke fuldt ud bioorthogonal, kræver lav pH (4,5) og lang reaktionstid (> 60 h), mens azider såsom p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11og en indeholder derivat af lysin (AzK)12,13 kan nedsættes i celle14, og kobber bruges til at katalysere Huisgen cycloadditioner kan fremkalde oxidative skader 15.
Selv om alternative ncAAs baseret på trans-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) og bicyclo [6.1.0] none (BCN) har for nylig blevet kodet i et antistof til bio-imaging formål, udtryk system lider meget lave udbytter (0,5 mg/L)16. Desuden cyclooctenes og cyclooctynes er store og hydrofobe håndtag, der kan øge modtagelighed af ADC for sammenlægning -ADC nyttelast er traditionelt hydrofobe og de fysisk-kemiske egenskaber af linker har vist for stærkt virkningen farmakokinetik og terapeutisk indeks17. 1,3-disubstitued cyclopropenes er derimod lille reaktive grupper, der burde aktivere minimal ændring i protein struktur og physichochemical egenskaber18. Cyclopropenes reagere selektivt og hurtigt med tetrazines via en invers elektron-demand Diels-elletræ cycloaddition19. I denne protokol gør vi brug af et derivat af lysin (CypK, figur 1b) forsynet med en methyl-cyclopropene, der er mindre påvirket af sterisk hindring end større anstrengt umættede cyklusser og har en reaktion konstant i størrelsesordenen 1-30 M-1s -1 i vandige medier18,20.
Vi har for nylig rapporteret hvordan at indarbejde antistoffer til at generere ADCs ved at reagere denne minimale bioorthogonal håndtag med tetrazine-bærende molekyler21CypK. Her beskriver vi ADC forberedelse procedure mere detaljeret med vægt på de mest udfordrende skridt. Indarbejdelse af CypK er rettet ved hjælp af en pyrrolysyl-tRNA syntetase (PylRS) / tRNACUA(PylT) pair som svar på en rav codon indført i antistof tunge kæde (HC)22. Her bruger vi to plasmider for forbigående Transfektion (figur 1a), en kodning den tunge kæde af antistoffet og andre et kodning lys kæden (LC), begge indeholdende PylRS/PylT-kassette. Alternativt kan en stabil cellelinie, der giver mulighed for højere antistof udbytter genereres gennem en mere omstændelig procedure21.
De ovennævnte udtryk systemer kan producere terapeutiske anti-HER2 immunoglobulin 1 (IgG1) trastuzumab med CypK på nogenlunde samme niveau til det vilde type antistof. Vi valgte den første position af domænet CH1 på den tunge kæde at indkode ncAA (HC-118TAG). Dette er den mest almindeligt modificerede site i ADCs23 og er kendt som HC-118 (EU nummerering) men er også blevet refereret til som HC-121 (sekvens holdning) og HC-114 (Kabat nummerering)24. Da denne stilling er bevaret gennem alle IgG1s, bør disse udtryk systemer være genstand for mest terapeutisk antistoffer.
Vi viser trastuzumab(CypK)2 kan nemt renses af protein en efterfulgt af hurtig protein væskekromatografi med en hydrofob vekselvirkning kolonne (FPLC-HIC). Efterfølgende er antistoffet kovalent knyttet inden for 3 h til mikrotubulus polymerisering hæmmer mellem auristatin E (MMAE), som bruges i FDA-godkendt ADC Adcetris. Her bruger vi en benzyl-tetrazine afledning af MMAE (tetrazine-vcMMAE) med en linker bestående af en glutarate spacer og en valin-citrullin protease-labil komponent efterfulgt af en p– aminobenzylalcohol self-immolative enhed; denne linker er kløvet af Cathepsin B i lysosomet ved internalisering af ADC resulterer i traceless udgivelsen af toksin25. For at vise den brede anvendelsesområde reaktion, antistoffet er også knyttet til fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA). Vi forklare, hvordan til at bekræfte identiteten af konjugationen af væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) og til at beregne stof til antistof-ratio (DAR) ved hjælp af højtryksvæskekromatografi med en hydrofob vekselvirkning kolonne (HPLC-HIC) .
Som en del af karakterisering af antistof ydeevne beskriver vi, hvordan at teste stabilitet af dihydropyridazine kobling i humant serum. Denne parameter er lettere vurderet i trastuzumab-TAMRA, fordi det kan kvantificeres ved hjælp af en simpel ELISA og fortolkningen af resultaterne er ikke kompliceret af protease labile komponent i trastuzumab(MMAE)2. Endelig vurderes selektivitet og styrken af trastuzumab(MMAE)2 ved at sammenligne ADC cytoxicity på tværs af cellelinjer udtrykke forskellige niveauer af HER2. Denne analyse giver også en funktionel bevis af ADC stabilitet når udført efter inkubation immunoconjugate i humant serum.
At producere trastuzumab(CypK)2 i denne protokol beskrevne forbigående udtryk procedure er enkel og giver mulighed for høj modularitet. De udbytter, der er opnået inden for dem, der forventes i en akademisk indstilling27 og stabil cellelinjer kan genereres for at yderligere øge produktionen udbytte21. Under udtryk lavere koncentrationer af CypK end 5 mM kan resultere i lavere ncAA inkorporering, og større mængder kan påvirke cellevækst og mindske antistof udbytter. CypK som en gratis aminosyre har lav vandopløselighed, således det skal først opløst på 100 mM i 0,1 M NaOH og derefter tilføjes til næringssubstratet. Efter fortynding CypK på mellemlang og før du føjer det til celler, er det kritisk at neutralisere medium med HCl og filter til at sterilisere. Efterfølgende, ved hjælp af Transfektion reagenser angivet i denne protokol og efter de af fabrikanten anbefalede inkuberingstider er vigtigt for en højtydende udtryk. Yderligere oplysninger om forbigående udtryk for humane antistoffer henvises læseren til andre publicerede protokoller31,32.
Når antistoffet er renset, der en høj overskud af protein A harpiks kræves angivet for at sikre fuld antistof pull ned fra supernatanten. For at undgå udfældning af trastuzumab under eluering, er det anbefalelsesværdigt at bruge en løsning med høj buffer kapacitet, fortyndes straks med PBS og udveksle bufferen at undgå overdreven koncentration. Altid holde antistoffet < 5 mg/mL.
Konjugering af trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE er hurtigere end de fleste reaktioner rapporteret med andre bioorthogonal håndtag til ADCs. Desuden, denne cycladdition opstår meget milde betingelser: stuetemperatur eller lavere og fysiologisk pH. Det er vigtigt at fortynde DMSO stamopløsninger af reaktanter med acetonitril før tilsætning af PBS og antistof; ellers vil tetrazine derivater bundfald. Acetonitril kræves kun på grund af den høje hydrophobicity af MMAE og TAMRA, men mindre hydrofobe molekyler muligvis ikke tilføjelsen af en co opløsningsmiddel. Alternativt, tetrazine-vcMMAE kan være konjugeret uden acetonitril og kun 2 kindtand ækvivalenter af tetrazine-vcMMAE i 20 h. Dette lille beløb af toksin medføre et betydeligt fald i produktionsomkostningerne for ADC sammenlignet med nuværende ncAA-baserede teknologier. Trastuzumab(CypK)2 er fuldt reaktiv i mindst 4 måneder når bevaret ved 4 ° C.
HPLC-HIC muliggør en nøjagtig bestemmelse af DAR, da MMAE er meget hydrofobe og giver en fremragende opløsning af toppene svarende til antistof konjugater med 0, 1 og 2 toksiner. Ureageret tetrazine-vcMMAE eluerer omkring 13,7 min og er registreret på 280 nm. Denne teknik kræver en råvare med høj renhed. Derudover er det ikke anbefalelsesværdigt at slukke reaktion med andre tetrazine-reaktiv molekyler såsom BCN-OH, da de kan ændre retentionstiderne og formen af toppene. Det er vigtigt at saltkoncentration af prøverne matcher den ene i den mobile fase i starten af forløbet for at opnå en god adskillelse, især hvis mere end 10-20 µL injiceres.
LC-MS analyse er deglycosylation af antistof prøver forpligtet til at opnå en enkelt peak ved deconvolution af rå spektret. Nøjagtigheden af de samlede antistof og ADC masserne kan variere afhængigt af callibration af instrumentet. Derfor, for at beregne massen for ændringen, subtrahere massen opnået for de umodificerede antistoffer fra den opnåede ADC. Moderne høj opløsning massespektrometre bør give en relativ fejl under 1: 10000. Selv om LC-MS kan også bruges til at beregne forholdet mellem de forskellige arter, er denne værdi normalt en overvurdering fordi ændringen kan påvirke ionisering kapaciteten af de arter, der er genereret og lavt beløb af urenheder kan ikke påvises.
Stabiliteten i linker i ADCs er kritisk, fordi den for tidlig frigivelse af narkotika resulterer i højere toksicitet og lavere effektivitet; den gratis cytotoxin skader sunde væv og de nøgne antistof konkurrerer med den væbnede for bindende målwebsteder på syge celler. En udgivelse under 5%, som er inden for variabiliteten af stabilitet analysen, bør forventes.
Endelig en ADC målretning HER2 som trastuzumab(MMAE)2 kan vurderes ved at sammenligne cytotoksicitet i SK-BR-3 celler (HER2 høj) og MCF-7 celler (HER2 lav) siden den sidstnævnte express 15-fold mindre HER2-receptorer end tidligere28 selektivitet . Immunoconjugate forventes at resultere i en celle levedygtighed mindst 2 størrelsesordener lavere i SK-BR-3 i forhold til MCF-7. EF50 i SK-BR-3 bør være i tocifrede nanomolar intervallet afspejler den høj potens af denne ADC29,30. Den umodificerede antistof, enten trastuzumab(MMAE)2 eller trastuzumab, skal vise nogen toksicitet i denne analyse. Tetrazine-vcMMAE skal have en virkning 3 størrelsesordener lavere end ADC, da linker fjerner aktivitet af peptidomimetic toksin. Omvendt, fordi MMAE er i stand til at præge cellemembranen30, bør det har en lignende toksicitet for ADC men viser ingen forskelsbehandling mellem HER2 høj og HER2 lav cellelinjer. Desuden, hvis denne analyse er udført efter en 5-dages inkubation af ADC i serum, det kan bruges til at give en funktionel bevis for stabiliteten i linker: en frigørelse af toksin ville resultere i enten en nedgang i ADC effektivitet i SK-BR-3, hvis MMAE blev udgivet sammen med p kunst af linker eller et fald i selektivitet hvis linker blev kløvet i en traceless mode.
ADC-teknologi beskrevet heri giver mulighed for effektiv og lokationsspecifikke inkorporering af en cyclopropene derivat af lysin i IgG1s. Efter en letkøbt rensning, antistoffer kan hurtigt konjugeret med tetrazine-holdige molekyler, fremstilling af homogene produkter. På grund af den lille størrelse og høje reaktivitet af cyclopropene minimal håndtag, bør denne metode aktiverer konjugering af sterically hindres nyttelast. De resulterende immunoconjugates er stabil i serum og yderst potent og selektiv. Samlet set muliggør CypK en hurtig, lokationsspecifikke og stabil bioorthogonal kobling til antistof og andre protein konjugater skal bruges i terapi eller diagnose.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den medicinske Forskningsråd, UK. BO-S. holder en EMBO fellowship (ATLF 158-2016) og er taknemmelig H. Pelham og JW hage for støtte, og G. Kym, C. W. Morgan og O. Perisic for hjælp og rådgivning.
Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | – | Costum synthesized |
Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
NanoAcquity | Waters | ||
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
CO2 incubator | Panasonic | ||
HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
TMB | BioLengend | 421101 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |