एंटीबॉडी में lysine के व्युत्पंन एक cyclopropene शामिल साइट की अनुमति देता है, tetrazine असर अणुओं के विशिष्ट, तेजी से और कुशल संपर्क एंटीबॉडी-दवा conjugates उत्पंन करने के लिए ।
एंटीबॉडी-ड्रग conjugates (ADCs) नैदानिक अभ्यास में आजकल इस्तेमाल किया एंटीबॉडी विभिंन पदों पर विषाक्त पदार्थों की एक अलग संख्या से जुड़े अणुओं के मिश्रण हैं । नैदानिक अध्ययन से पता चला है कि इन पारंपरिक ADCs के चिकित्सीय सूचकांक विषाक्त पदार्थों के साइट विशेष संबंध द्वारा सुधार किया जा सकता है । हालांकि, वर्तमान दृष्टिकोण सजातीय ADCs उत्पादन करने के लिए कई सीमाएं हैं, जैसे कि कम प्रोटीन अभिव्यक्ति और धीमी प्रतिक्रिया कैनेटीक्स । इस प्रोटोकॉल में हम वर्णन कैसे स्थापित करने के लिए एक अभिव्यक्ति प्रणाली को शामिल करने के लिए एक cyclopropene व्युत्पंन lysine (CypK) एंटीबॉडी में आनुवंशिक कोड के विस्तार का उपयोग कर । इस मिनिमल bioorthogonal संभाल एक व्युत्क्रम मांग Diels-Alder cycloaddition के माध्यम से tetrazine डेरिवेटिव के तेजी से विकार की अनुमति देता है । यहां अभिव्यक्ति प्रणाली की रिपोर्ट सतही उत्पादन और भारी श्रृंखला में से प्रत्येक में trastuzumab असर CypK के शोधन सक्षम बनाता है । हम बताते है कि कैसे विष को एंटीबॉडी लिंक करने के लिए monomethyl auristatin ई और hydrophobic इंटरेक्शन क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा immunoconjugate की विशेषताएं । अंत में, हम dihydropyridazine विकार से उत्पंन लिंकेज के मानव सीरम में स्थिरता का आकलन करने के लिए और HER2 रिसेप्टर के उच्च स्तर के साथ स्तन कैंसर कोशिकाओं के लिए ADC के चयनात्मक cytotoxicity परीक्षण करने के लिए परख का वर्णन.
एंटीबॉडी-औषध conjugates (ADCs) के selectivity से जुडा है और छोटे साइटोटोक्सिक अणुओं की शक्ति । सबसे ADCs उद्देश्य दवाओं है कि डीएनए या microtubule बहुलकीकरण कैंसर कोशिकाओं को प्रभावित लक्ष्यीकरण द्वारा पारंपरिक कीमोथेरेपी के दुष्प्रभाव कम करने के लिए1। पहली पीढ़ी के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित ADCs lysines और cysteines, जो कम pharmacokinetic गुण2के साथ विभिंन पदों पर संशोधित अणुओं के मिश्रण उत्पंन के संशोधन पर भरोसा करते हैं । इसके विपरीत, साइट विशेष विकार दवाओं के एंटीबॉडी के लिए सुधार चिकित्सकीय indeces3,4के साथ यौगिकों उत्पंन कर सकते हैं । सजातीय ADCs उत्पादन की चुनौती का पता करने की मांग, कई चुनिंदा रासायनिक और एंजाइमी संशोधनों1,5रिपोर्ट किया गया है । हालांकि, वर्तमान तरीके एंटीबॉडी पर केवल कुछ स्थिति लक्षित कर सकते हैं, कम प्रोटीन अभिव्यक्ति से पीड़ित, कम स्थिरता के साथ लिंक प्रदान, या धीमी और कम उपज प्रतिक्रियाओं पर भरोसा करते हैं ।
गैर का निगमन-विहित अमीनो एसिड (ncAA) आनुवंशिक कोड के विस्तार के माध्यम से सक्षम बनाता है साइट-प्रोटीन में bioorthogonal प्रतिक्रियाशील समूहों की एक बहुतायत की विशिष्ट अधिष्ठापन, संभावित अंय उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की सीमाओं पर काबू पाने ADCs. एक लक्ष्य (stop) codon के जवाब में ncaas एंकोडिंग aminoacyl पर निर्भर करता है-tRNA synthetase/tRNA जोड़े कि ओर्थोगोनल जोड़े कि विहित अमीनो एसिड6को शामिल करने के लिए अंतर्जात हैं । कई ncaas एंटीबॉडी में शामिल किया गया है ADCs उत्पंन करते हैं । तथापि, अधिकांश चिकित्सीय औषध विकार में आवेदनों के लिए विभिन्न देयताओं से पीड़ित हैं. पी-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 पूरी तरह से bioorthogonal नहीं है, कम पीएच (४.५) और लंबी प्रतिक्रिया समय (> ६० एच) की आवश्यकता है, जबकि azides जैसे पी-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, पी-azidomethylphenylalanine (pAMF)11, और lysine (AzK)12,13 के एक azide व्युत्पंन सेल14में कम हो सकता है, और तांबे उत्प्रेरित Huisgen cycloadditions के लिए इस्तेमाल ऑक्सीडेटिव नुकसान पैदा कर सकता है 15.
हालांकि ट्रांस cyclooctene (TCO), cyclooctyne (एससीओ) और bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) पर आधारित वैकल्पिक ncaas हाल ही में जैव इमेजिंग प्रयोजनों के लिए एक एंटीबॉडी में इनकोडिंग गया है, अभिव्यक्ति प्रणाली बहुत कम पैदावार से ग्रस्त है (०.५ mg/L)16. इसके अलावा, cyclooctenes और cyclooctynes बड़े और hydrophobic हैंडल हैं जो एकत्रीकरण के लिए एडीसी की संवेदनशीलता को बढ़ा सकते हैं-एडीसी पेलोड परंपरागत रूप से hydrophobic हैं और लिंकर के भौतिक गुणों को काफी दिखाया गया है प्रभाव फार्माकोकाइनेटिक्स और चिकित्सीय सूचकांक17। इसके विपरीत, 1, 3-disubstitued cyclopropenes छोटे प्रतिक्रियाशील समूह है कि प्रोटीन संरचना और physichochemical गुण18में ंयूनतम परिवर्तन का कारण होना चाहिए रहे हैं । Cyclopropenes चुनिंदा और तेजी से एक व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन के माध्यम से tetrazines के साथ प्रतिक्रिया-मांग Diels-Alder cycloaddition19। इस प्रोटोकॉल में हम lysine के व्युत्पंन का उपयोग करें (CypK, आंकड़ा 1b) एक मिथाइल-cyclopropene है कि कम steric बाधा से बड़ा तनावपूर्ण संतृप्त चक्र से प्रभावित है और एक प्रतिक्रिया की दर 1-30 एम के क्रम में लगातार है असर-1s -1 जलीय मीडिया में18,20।
हमने हाल ही में बताया कैसे एंटीबॉडी में CypK को शामिल करने के लिए इस ंयूनतम bioorthogonal tetrazine के साथ संभाल-21अणुओं असर द्वारा ADCs उत्पंन करते हैं । यहाँ हम सबसे चुनौतीपूर्ण चरणों पर जोर देने के साथ और अधिक विस्तार में ADC तैयारी प्रक्रिया का वर्णन. CypK के शामिल एक pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNA कूए (PylT) जोड़ीएक एंबर codon भारी श्रृंखला (कोर्ट)22में पेश करने के लिए जवाब में का उपयोग करने का निर्देश दिया है । यहाँ हम क्षणिक अभिकर्मक के लिए दो plasmids का उपयोग करें (आंकड़ा 1a), एक एंटीबॉडी की भारी श्रृंखला एन्कोडिंग और अन्य एक प्रकाश श्रृंखला एन्कोडिंग (नियंत्रण रेखा), दोनों PylRS/PylT कैसेट युक्त. वैकल्पिक रूप से, उच्च एंटीबॉडी पैदावार सक्षम करता है एक स्थिर कक्ष रेखा से अधिक श्रमसाध्य प्रक्रिया21के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है ।
aforementioned अभिव्यक्ति प्रणालियों चिकित्सीय विरोधी HER2 immunoglobulin 1 (IgG1) trastuzumab CypK के साथ जंगली प्रकार एंटीबॉडी के समान स्तर पर उत्पादन कर सकते हैं । हम भारी श्रृंखला के ncAA (HC-118TAG) सांकेतिक शब्दों में बदलना करने पर CH1 डोमेन की पहली स्थिति का चयन किया । इस ADCs23 में सबसे अधिक संशोधित साइट है और एचसी-११८ (यूरोपीय संघ क्रमांकन) के रूप में जाना जाता है, लेकिन यह भी एचसी-१२१ (अनुक्रम स्थिति) और hc-११४ (Kabat क्रमांकन)24के रूप में भेजा गया है । चूंकि यह स्थिति सभी IgG1s भर में संरक्षित है, इन अभिव्यक्ति प्रणालियों सबसे चिकित्सीय एंटीबॉडी के लिए उत्तरदायी होना चाहिए.
हम trastuzumab (CypK)2 शो आसानी से एक hydrophobic बातचीत कॉलम (FPLC-HIC) के साथ तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा प्रोटीन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है । बाद में एंटीबॉडी covalently 3 ज के भीतर जुड़ा हुआ है microtubule बहुलकीकरण अवरोध करनेवाला monomethyl auristatin E (MMAE), जो एफडीए अनुमोदित ADC Adcetris में प्रयोग किया जाता है. यहां हम एक benzyl-tetrazine MMAE के व्युत्पंन का उपयोग करें (tetrazine-vcMMAE) एक glutarate स्पेसर और एक वैलिन-citrulline-labile एक पीaminobenzylalcohol स्व-immolative इकाई के बाद घटक शामिल एक linker के साथ; इस लिंकर Cathepsin बी द्वारा lysosome में ADC के internalization विष25के स्ट्रेस्ड रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप से सट गया है. प्रतिक्रिया का व्यापक दायरा दिखाने के लिए एंटीबॉडी को fluorophore tetramethylrhodamine (तमृ) से भी जोड़ा गया है । हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) के लिए युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा संयुग्मी की पहचान को सत्यापित करने के लिए और एक क्रोमैटोग्राफी बातचीत कॉलम (hydrophobic-HPLC) के साथ उच्च प्रदर्शन तरल HIC का उपयोग कर दवा के लिए एंटीबॉडी अनुपात (डार) की गणना करने के लिए कैसे समझाओ .
एंटीबॉडी प्रदर्शन के लक्षण वर्णन के भाग के रूप में, हम का वर्णन कैसे मानव सीरम में dihydropyridazine लिंकेज की स्थिरता का परीक्षण करने के लिए । यह पैरामीटर trastuzumab-तमृ में अधिक आसानी से मूल्यांकन किया जाता है क्योंकि यह एक साधारण एलिसा द्वारा quantified जा सकता है और परिणामों की व्याख्या को trastuzumab (MMAE)2के टीज़ labile घटक द्वारा जटिल नहीं है । अंत में, selectivity और trastuzumab की शक्ति (MMAE)2 HER2 के विभिन्न स्तरों व्यक्त सेल लाइनों में ADC के cytoxicity की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया है. यह परख भी ADC स्थिरता के एक कार्यात्मक सबूत प्रदान करता है जब मानव सीरम में immunoconjugateing के बाद प्रदर्शन किया ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित trastuzumab (CypK)2 का उत्पादन करने के लिए क्षणिक अभिव्यक्ति प्रक्रिया सरल है और उच्च मॉड्यूलरता के लिए अनुमति देता है । प्राप्त पैदावार एक अकादमिक स्थापित करने में उंमीद लोगों के भीतर है27 और स्थिर सेल लाइनों को आगे उत्पादन21उपज को बढ़ावा देने के उत्पंन किया जा सकता है । अभिव्यक्ति के दौरान, 5 मिमी से कम CypK की सांद्रता कम ncAA निगमन में परिणाम हो सकता है, और अधिक मात्रा सेल विकास को प्रभावित और एंटीबॉडी पैदावार कम हो सकती है. एक मुक्त एमिनो एसिड के रूप में CypK कम पानी घुलनशीलता है, इस प्रकार यह पहले ०.१ मीटर NaOH में १०० mM पर भंग किया जाना चाहिए और फिर संस्कृति माध्यम में जोड़ा । मीडियम में कमजोर CypK के बाद और इसे कोशिकाओं से जोड़ने से पहले, एचसीएल और फिल्टर को निष्फल करने के साथ मीडियम को बेअसर करना अहम है. बाद में, इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट अभिकर्मक रिएजेंट का उपयोग कर और निर्माता द्वारा अनुशंसित मशीन समय के बाद एक उच्च उपज अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है । मानव एंटीबॉडी के क्षणिक अभिव्यक्ति पर अधिक जानकारी के लिए, पाठक अंय प्रकाशित प्रोटोकॉल31,३२के लिए भेजा है ।
जब एंटीबॉडी शुद्ध है, प्रोटीन की एक उच्च अधिक एक राल के रूप में सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण एंटीबॉडी supernatant से नीचे खींचने के संकेत की आवश्यकता है । आदेश में रेफरेंस के दौरान trastuzumab की वर्षा को रोकने के लिए, यह उच्च बफरिंग क्षमता के साथ एक समाधान का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, पंजाबियों के साथ तुरंत पतला और अत्यधिक एकाग्रता से बचने बफर मुद्रा । हमेशा एंटीबॉडी रखें < 5 mg/
tetrazine-vcMMAE के साथ trastuzumab (CypK)2 के विकार bioorthogonal के लिए अन्य ADCs हैंडल के साथ रिपोर्ट की तुलना में तेजी से है । इसके अलावा, इस cycladdition बहुत हल्के स्थितियों के तहत होता है: कमरे के तापमान या कम और शारीरिक पीएच । यह acetonitrile के साथ reactants के DMSO स्टॉक समाधानों को पतला करने के लिए महत्वपूर्ण है जो पहले पंजाब और एंटीबॉडी के अलावा; अंयथा tetrazine डेरिवेटिव वेग होगा । Acetonitrile केवल MMAE और तमृ के उच्च hydrophobicity के कारण आवश्यक है, लेकिन कम hydrophobic अणुओं एक सह विलायक के अलावा की जरूरत नहीं हो सकती है । वैकल्पिक रूप से, tetrazine-vcMMAE को बिना acetonitrile के संयुग्मित जा सकता है और 20 ज के भीतर दाढ़-tetrazine के केवल 2 vcMMAE समकक्ष । विष की यह छोटी राशि ADC के निर्माण की लागत में पर्याप्त कमी को शामिल कर सकता है जब वर्तमान ncAA-आधारित प्रौद्योगिकियों की तुलना में. 4 ° c पर संरक्षित करते समय Trastuzumab (CypK)2 पूरी तरह से 4 महीने के लिए प्रतिक्रियाशील है ।
HPLC-HIC डार का सही निर्धारण सक्षम बनाता है के बाद से MMAE अत्यधिक hydrophobic है और 0, 1 और 2 विषाक्त पदार्थों के साथ एंटीबॉडी conjugates को इसी चोटियों का एक उत्कृष्ट संकल्प प्रदान करता है । १३.७ मिनट के आसपास unreact-vcMMAE elutes और २८० एनएम पर पता चला है । इस तकनीक उच्च शुद्धता के साथ एक प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता है । इसके अलावा, यह BCN जैसे अंय tetrazine-प्रतिक्रियाशील अणुओं के साथ प्रतिक्रिया बुझाने के लिए अनुशंसित नहीं है-ओह, क्योंकि वे प्रतिधारण समय और चोटियों के आकार को बदल सकते हैं । यह आवश्यक है कि नमूने के नमक एकाग्रता ढाल के शुरू में एक मोबाइल चरण में एक मैच के क्रम में एक अच्छा जुदाई प्राप्त करने के लिए, खासकर अगर अधिक से अधिक 10-20 µ एल इंजेक्शन हैं ।
LC-MS विश्लेषण के बारे में, एंटीबॉडी नमूनों की deglycosylation कच्चे स्पेक्ट्रम के deconvolution पर एक एकल चोटी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । कुल एंटीबॉडी और ADC मास की शुद्धता साधन के callibration के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, आदेश में संशोधन के लिए बड़े पैमाने पर गणना करने के लिए, ADC के लिए प्राप्त एक से unmodified एंटीबॉडी के लिए प्राप्त जन घटाना. आधुनिक उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर 1:10000 नीचे एक रिश्तेदार त्रुटि प्रदान करना चाहिए । हालांकि LC-MS भी विभिंन प्रजातियों के बीच अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस मूल्य आमतौर पर एक अनुमान है क्योंकि संशोधन उत्पंन प्रजातियों की ionization क्षमता को प्रभावित कर सकता है और अशुद्धियों की कम मात्रा का पता नहीं किया जा सकता है ।
ADCs में लिंकर की स्थिरता महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च विषाक्तता और कम प्रभावकारिता में दवा परिणामों के समयपूर्व जारी; मुक्त cytotoxin नुकसान स्वस्थ ऊतकों और नग्न एंटीबॉडी रोगग्रस्त कोशिकाओं पर लक्ष्य बंधन साइटों के लिए सशस्त्र एक के साथ प्रतिस्पर्धा । 5% है, जो स्थिरता परख की परिवर्तनशीलता के भीतर है के नीचे एक रिलीज की उंमीद की जानी चाहिए ।
अंत में, trastuzumab (MMAE)2 के रूप में एक ADC लक्ष्यीकरण HER2 के selectivity SK-BR-3 कोशिकाओं में cytotoxicity की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता (HER2 उच्च) और MCF-7 कोशिकाओं (HER2 कम) बाद एक्सप्रेस 15 गुना से कम HER2 रिसेप्टर्स पूर्व28 . immunoconjugate एक कोशिका व्यवहार्यता में परिणाम की उंमीद है कम परिमाण के 2 आदेश SK-BR-3 में कम जब MCF-7 की तुलना में । चुनाव आयोग५० SK-BR-3 में दो अंक nanomolar रेंज में होना चाहिए इस एडीसी29,30की उच्च शक्ति को दर्शाती है । संशोधित एंटीबॉडी, या तो trastuzumab (MMAE)2 या trastuzumab, इस परख में कोई विषाक्तता दिखाना चाहिए । Tetrazine-vcMMAE एक प्रभाव ADC से कम परिमाण के 3 आदेश होना चाहिए के बाद से linker peptidomimetic विष की गतिविधि को हटा. इसके विपरीत, क्योंकि MMAE सेल झिल्ली30रिस करने में सक्षम है, यह ADC करने के लिए एक समान विषाक्तता है, लेकिन HER2 उच्च और HER2 कम सेल लाइनों के बीच कोई भेदभाव प्रदर्शित करना चाहिए. इसके अलावा, यदि इस परख एक 5 के बाद किया जाता है सीरम में एडीसी के दिन की मशीन, यह लिंकर की स्थिरता का एक कार्यात्मक सबूत प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: विष की एक रिलीज के लिए या तो में एडीसी दक्षता में कमी का परिणाम होगा SK-BR-3 अगर MMAE पी के साथ जारी किया गया था लिंकर की कला या selectivity में कमी अगर लिंकर एक स्ट्रेस्ड फैशन में सट गया था ।
ADC प्रौद्योगिकी यहां वर्णित कुशल और साइट-IgG1s में lysine के व्युत्पंन एक cyclopropene के विशिष्ट शामिल करने की अनुमति देता है । एक सतही शुद्धि के बाद, एंटीबॉडी तेजी से tetrazine युक्त अणुओं के साथ संयुग्मित जा सकता है, समरूप उत्पादों उपज । छोटे आकार और cyclopropene ंयूनतम संभाल के उच्च जेट के कारण, इस विधि sterically बाधा पेलोड के विकार सक्षम होना चाहिए । परिणामस्वरूप immunoconjugates सीरम में स्थिर रहे है और अत्यधिक शक्तिशाली और चयनात्मक हैं । कुल मिलाकर, CypK चिकित्सा या निदान में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एंटीबॉडी और अन्य प्रोटीन conjugates के लिए एक तेजी से, साइट विशेष और स्थिर bioorthogonal लिंकेज सक्षम बनाता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम को मेडिकल रिसर्च काउंसिल, यूके ने सपोर्ट किया था । शास-एस. एक EMBO फैलोशिप (ATLF 158-2016) रखती है और समर्थन के लिए एच पेल्हम और J.W. चिन के लिए आभारी है, और जी वतनी, सी. डब्ल्यू. मॉर्गन, और ओ Perisic मदद और सलाह के लिए ।
Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | – | Costum synthesized |
Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
NanoAcquity | Waters | ||
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
CO2 incubator | Panasonic | ||
HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
TMB | BioLengend | 421101 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |