एक उच्च प्रवाह, उच्च सामग्री, तरल आधारित सी. एलिगेंस Pathosystem
Summary
यहाँ हम एक अनुकूलनीय, पूरे मेजबान, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उपकरण है कि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और दवा की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
नए पारंपरिक द्वारा पहचान की दवाओं की संख्या, इन विट्रो स्क्रीन कम हो गया है, नए हथियारों के लिए खोज में इस दृष्टिकोण की सफलता को कम करने के लिए कई दवा प्रतिरोध का मुकाबला । यह निष्कर्ष है कि शोधकर्ताओं ने न केवल नई दवाओं को खोजने की जरूरत है, लेकिन यह भी उंहें खोजने के नए तरीके विकसित करने की आवश्यकता के लिए नेतृत्व किया है । सबसे होनहार उंमीदवार के बीच में पूरे जीव हैं, vivo परख में है कि उच्च प्रवाह का उपयोग करें, phenotypic readouts और मेजबान है कि Caenorhabditis एलिगेंस से ढाणियो rerioको सीमा । इन मेजबानों कई शक्तिशाली लाभ है, झूठी सकारात्मक हिट में नाटकीय कटौती सहित, यौगिकों कि मेजबान के लिए विषाक्त कर रहे है के रूप में और/आम तौर पर प्रारंभिक स्क्रीन में गिरा रहे हैं, महंगा पालन करने से पहले ।
यहां हम बताएंगे कि कैसे हमारे परख के लिए अच्छी तरह से प्रलेखित सी एलिगेंस–Pseudomonas aeruginosa तरल हत्या pathosystem में मेजबान भिंनता पूछताछ इस्तेमाल किया गया है । हम यह भी अच्छी तरह से बाहर काम तकनीक के कई एक्सटेंशन का प्रदर्शन । उदाहरण के लिए, हम उच्च प्रवाह आनुवंशिक स्क्रीन 24-या ९६-well प्लेट स्वरूपों में RNAi का उपयोग करने के लिए इस होस्ट-रोगज़नक़ सहभागिता में क्वेरी होस्ट कारकों को पूरा करने में सक्षम हैं । इस परख का प्रयोग, पूरे जीनोम स्क्रीन केवल कुछ ही महीनों में पूरा किया जा सकता है, जो नाटकीय रूप से दवा लक्ष्य की पहचान के कार्य को सरल कर सकते हैं, संभावित श्रमसाध्य जैव रासायनिक शोधन दृष्टिकोण के लिए आवश्यकता के बिना ।
हम यहां अपनी विधि की एक भिंनता भी रिपोर्ट करते है जो ग्राम-धनात्मक जीवाणु Enterococcus faecalis को चने-नकारात्मक रोगजनक पी aeruginosaके लिए प्रतिस्थापित करता है । बहुत के रूप में पी aeruginosaके लिए मामला है, ई. faecalis द्वारा हत्या समय निर्भर है । के विपरीत पिछले सी एलिगेंस–ई. faecalis परख, हमारे ई. faecalis के लिए परख संक्रमण की आवश्यकता नहीं है, अपनी सुरक्षा प्रोफ़ाइल में सुधार और तरल पदार्थ-हैंडलिंग उपकरण दूषित होने की संभावना को कम करने । परख अत्यधिक मजबूत है, दिखा ~ ९५% मृत्यु दर ९६ एच पद संक्रमण ।
Introduction
पहचान और प्रभावी, व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के विकास, अब लगभग एक सदी पहले, सार्वजनिक स्वास्थ्य में एक वाटरशेड पल के लिए नेतृत्व किया जहां एक व्यापक प्रसार विश्वास है कि संक्रामक रोग अतीत की एक संकट होगा था । कुछ ही दशकों के भीतर, यह आशावाद कम करने के लिए शुरू हुआ, रोगज़नक़ के बाद रोगज़नक़ प्रतिरोध तंत्र विकसित किया है कि इन सीमित एक बार चमत्कारी उपचार । कुछ समय के लिए, दवा की खोज के प्रयासों और रोगजनकों के बीच हथियारों की दौड़ संतुलित लग रहा था । हालांकि, रोगाणुरोधी के दुरुपयोग Klebsiella निमोनिया, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens, और पी aeruginosa1के पान दवा प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव में हाल ही में समापन किया गया है, 2,3,4.
पी aeruginosa एक अवसरवादी, ग्राम नकारात्मक, मल्टी होस्ट रोगज़नक़ कि गंभीर जलता है, जो प्रतिरक्षा हैं, या सिस्टिक फाइब्रोसिस है के साथ रोगियों के लिए एक गंभीर खतरा है । यह भी तेजी से गंभीर nosocomial संक्रमण, विशेष रूप से रोगाणुरोधी प्रतिरोध के अपने चल रहे अधिग्रहण के कारण में एक प्रेरणा का एजेंट के रूप में पहचान की है । इस खतरे को हल करने के लिए शुरू करने के लिए, हम अच्छी तरह से प्रलेखित सी एलिगेंस–P. aeruginosa संक्रमण प्रणाली का इस्तेमाल किया है5. हमारी प्रयोगशाला इस प्रणाली के लिए एक तरल आधारित विकसित करने के लिए leveraged है, उच्च प्रवाह, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग मंच उपंयास यौगिकों कि रोगज़नक़ की क्षमता को सीमित करने के लिए मेजबान6को मारने की पहचान । साज़िश, इन यौगिकों7 रोगाणुरोधी और डाह अवरोध करनेवाला8सहित सामान्य से कम तीन श्रेणियों, से संबंधित करने के लिए लग रहे हैं. सी. एलिगेंस में अन्य उच्च सामग्री औषध खोज परख माइकोबैक्टीरियम tuberculosum, क्लैमाइडिया trachomatis, Yersinia pestis, लिस्टिरिया monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, के लिए सूचित किया गया है और Enterococcus faecalis,9,10,11,12,13,14,15,16अंय लोगों के बीच । परख के इन प्रकार के कई अच्छी तरह से मांयता प्राप्त लाभ, ऐसे झूठी सकारात्मक हिट है कि दोनों मेजबान और रोगज़नक़, जैव उपलब्धता की एक रासायनिक स्क्रीन की तुलना में वृद्धि की संभावना को विषाक्त हो सकता है सीमित के रूप में है, और हिट से परे की पहचान करने की क्षमता बस ऐसे विरोधी virulents, प्रतिरक्षा stimulatory अणुओं, या यौगिकों कि अंयथा पूर्व के पक्ष में मेजबान रोगज़नक़ संपर्क के संतुलन झुकाव के रूप में माइक्रोबियल विकास, सीमित । साथ ही, इन स्क्रीन में खोजे गए यौगिकों अक्सर स्तनधारी होस्ट्स में प्रभावी होते हैं ।
यह ध्यान देने योग्य है कि दो अंय परख17,18 के लिए बाहर तरल में सी एलिगेंस में उच्च प्रवाह स्क्रीन ले उपलब्ध है लायक है । हालांकि, इन परख के प्रत्येक एक संशोधन है कि prototypical आंत्र-औपनिवेशीकरण परख, धीमी हत्या के रूप में जाना जाता है की अनुमति देता है, तरल में प्रदर्शन किया जा करने के लिए, प्रवाह में वृद्धि और अनुमति यौगिकों और अधिक आसानी से दिखलाई जा सकता है । सावधान लक्षण वर्णन निर्णायक प्रदर्शन किया है कि बैक्टीरियल डाह के तंत्र इन परख और हमारे तरल आधारित स्क्रीन7के बीच अलग हैं । के बाद से डाह के दोनों प्रकार के स्तनधारी प्रणालियों में मनाया जाता है, यह महत्वपूर्ण है पर विचार जो डाह निर्धारक है प्रयोगकर्ता हितों के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक है परख चयन से पहले ।
यहां हम तरल आधारित सी. एलिगेंस-P. aeruginosa परख के एक अनुकूलित संस्करण प्रदर्शित करता है । हम भी हमारे तरल आधारित परख विधि के अनुकूलन के लिए ग्राम-सकारात्मक जीवाणु रोगज़नक़ Enterococcus faecalis को समायोजित करने की रिपोर्ट । aeruginosaकी तरह, ई. faecalis तेजी से रोगाणुरोधी प्रतिरोध रास्ते1के बढ़ते आयुध के साथ एक गंभीर nosocomial खतरा के रूप में पहचान की है । हालांकि faecalis के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए पिछले एक विधि14मौजूद है, यह रोगज़नक़, जो प्रक्रिया पेचीदा और कोपा FlowSort की तरह दूषित उपकरणों की संभावना बढ़ जाती है के साथ संक्रमण की आवश्यकता है । हमारे प्रोटोकॉल पूर्व संक्रमण के लिए की जरूरत है, सुरक्षा प्रोफ़ाइल में सुधार समाप्त । अंत में, हम एक साधन है जिसके द्वारा इन परख के या तो खिला RNAi के साथ जोड़ा जा सकता है की रिपोर्ट, उपयोगकर्ता की अनुमति मेजबान कारकों है कि की स्थापना में एक भूमिका निभाने के लिए खोज करने के लिए, या प्रतिरोध करने के लिए, संक्रमण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस परख (या इसी तरह की परख जहां अंय रोगजनकों aeruginosa या ई. faecalisके लिए प्रतिस्थापित कर रहे हैं) प्रयोजनों की एक किस्म के लिए उपयोगी है, दवा की खोज सहित । यह भी डाह कारकों की पहचान, मेजबान रक्षा रास्ते के elucidation…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में कैंसर प्रिवेंशन एंड रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्सास (CPRIT) अवार्ड RR150044, वेल्च फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट सी-१९३०, और स्वास्थ्य K22 AI110552 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा NVK को सम्मानित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
Referências
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