Высокой пропускной способностью, высоким содержанием, на основе жидкости C. elegans Pathosystem
Summary
Здесь мы описываем протокол, который является адаптируемой, весь узел, высоким содержанием скрининга инструмент, который может быть использован для изучения взаимодействия хост возбудителя и использоваться для обнаружения наркотиков.
Abstract
Количество выявленных новых препаратов, традиционных, в пробирке экраны waned, уменьшения успех такого подхода в поисках новых видов оружия для борьбы с несколькими лекарственной устойчивости. Это привело к выводу, что исследователи не только необходимость поиска новых лекарств, но также должны разработать новые способы их обнаружения. Среди наиболее перспективных кандидатов методов всего организма, в естественных условиях assays что использование высокой пропускной способностью, фенотипические отсчетов и находится в диапазоне от Caenorhabditis elegans до данио рерио. Эти узлы имеют несколько мощных преимуществ, включая резкое сокращение в ложных положительных хитов, как соединения, которые являются токсичными для пребывания и/или biounavailable обычно переносятся в начальный экран, до дорогостоящих последующей вверх.
Здесь мы покажем, как нашего анализа была использована допросить хост вариации в документально C. elegans—Pseudomonas aeruginosa жидкого убийства pathosystem. Мы также продемонстрировать несколько расширений этой хорошо отработанные методики. Например мы в состоянии осуществлять генетические экраны высокой пропускной способности с помощью РНК-интерференции в 24 – или 96-луночных пластины форматы запросов хоста факторов в этом взаимодействии хост патогена. Используя этот assay, весь геном экранов может быть завершена только через несколько месяцев, которые могут значительно упростить задачу выявления лекарственных препаратов, потенциально без необходимости кропотливого биохимической очистки подходов.
Мы также приводим здесь вариант нашего метода, который заменяет грамположительные бактерии Enterococcus faecalis для грамотрицательных патогенов P. aeruginosa. Много, как это предусмотрено для P. aeruginosa, убийство E. faecalis зависит от времени. В отличие от предыдущих C. elegans—E. faecalis анализов, наши пробирного для E. faecalis не требует preinfection, повышение его безопасности профиля и уменьшая шансы заражения жидкость разгрузочное оборудование. Assay является очень надежной, показаны ~ 95% смертности 96 h пост инфекции.
Introduction
Выявление и развитие эффективных, широкого спектра действия антибиотиков, теперь почти столетие назад, привели к переломным моментом в области общественного здравоохранения где существует широкое распространение убеждение, что инфекционные болезни будет бедствием прошлого. В течение нескольких десятилетий короткие этот оптимизм начал ослабевать, как возбудитель после возбудителя механизмы сопротивления, которые ограничивают эти однажды чудесных лечения. На некоторое время гонка вооружений между усилиями обнаружения наркотиков и возбудители казалось сбалансированным. Однако неправомерное использование противомикробных препаратов недавно стало появление Пан лекарственной устойчивостью штаммов Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter заболеваний, Serratia marcescensи P. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa является оппортунистических, грам отрицательные, мульти хост возбудителя, является серьезной угрозой для больных с ожогами, те, кто с ослабленным иммунитетом или кистозный фиброз. Он также все чаще определяется как возбудитель в тяжелых нозокомиальных инфекций, особенно из-за его постоянной приобретения устойчивости к противомикробным препаратам. Чтобы приступить к решению этой угрозы, мы использовали документально C. elegans–P. aeruginosa инфекции системы5. Наша лаборатория использовала эту систему для разработки платформы на основе жидкости, высокой пропускной способности, высоким содержанием скрининг для выявления новых соединений, которые ограничивают способность возбудителя убить пребывания6. Интригующе эти соединения, как представляется, принадлежат по крайней мере три общие категории, включая антимикробные7 и вирулентности ингибиторы8. Другие анализы обнаружения наркотиков высоким содержанием в C. elegans были зарегистрированы для tuberculosum микобактерии, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, золотистый стафилококк, Candida albicans, и Enterococcus faecalis, среди других9,10,11,12,13,14,,1516. Эти типы анализов есть несколько хорошо признанных преимуществ, таких как ограничение ложных положительных хитов, которые могут быть токсичными для принимающей страны и возбудителя, увеличение вероятности биодоступность, по сравнению с химической экрана и возможность выявления хитов за пределами просто, ограничивая рост микроорганизмов, таких как анти virulents, иммунных стимулирующих молекул или соединения, которые в противном случае смещение баланса в хост возбудитель взаимодействия пользу бывшей. Кроме того соединения, обнаружил в эти экраны часто эффективны в млекопитающих хостов.
Стоит отметить, что по крайней мере два других анализов17,18 доступны для выполнения высокопроизводительных экраны в C. elegans в жидкости. Однако, каждый из этих анализов представляет собой модификацию, который позволяет прототипом assay кишечных колонизации, известный как медленно убийства, чтобы выполняться в жидкости, увеличивая пропускную способность и позволяет соединения для более легко проверяться. Тщательно характеристика убедительно продемонстрировал, что механизмы вирулентности бактерий отличаются между этих анализов и жидкости на основе экрана7. Поскольку оба типа вирулентности наблюдаются в системах млекопитающих, важно рассмотреть, какие детерминант вирулентности является наиболее актуальной для экспериментатора интересы до отбора пробы.
Здесь мы показываем, оптимизированной версии на основе жидкости C. elegans-P. aeruginosa assay. Мы также доклад адаптации нашего Пробирной жидкости на основе метода для размещения грамположительных бактерий возбудителя Enterococcus faecalis. Как P. aeruginosa E. faecalis во все большей степени определяется как угроза серьезного нозокомиальных с растущей вооружение антибиотикорезистентности пути1. Хотя предыдущий метод для высокопроизводительного скрининга E. faecalis существует14, он требует preinfection с возбудителя, который усложняет процедуру и повышает вероятность заражения оборудования как COPAS FlowSort. Наш протокол устраняет необходимость предварительной инфекции, улучшение профиль безопасности. Наконец мы сообщаем средств, по которому любой из этих анализов могут быть объединены с кормления интерференции, позволяя пользователю для поиска узла факторов, которые играют определенную роль в создании, или устойчивость к инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот assay (или аналогичных анализов, где другие патогены подставляются P. aeruginosa или E. faecalis) является полезным для целого ряда целей, в том числе лекарственных препаратов. Это также полезно для решения фундаментальных биологических вопросов, такие факторы вирулентности, выяснени…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано путем профилактики рака и исследовательский институт штата Техас (CPRIT) награда RR150044, Грант C исследовательский фонд Уэлч-1930 и национальных институтов из здравоохранения K22 AI110552 присуждена НВК. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
Referências
- Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
- Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
- Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
- Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
- Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
- Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
- Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
- Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
- Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
- Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
- Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).
- Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
- Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
- Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
- Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).
- Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).
- Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).
- Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
- Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
- Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
- Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).
- Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
- Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
- Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).
