बड़े हड्डी घावों की मरंमत के लिए इंजीनियर के उपंयास की संख्या लगातार हड्डी चिकित्सा बढ़ाने और अस्थि प्रत्यारोपण के साथ जुड़े जटिलताओं को दूर करने के उद्देश्य के साथ विस्तार हो रहा है । यहां, हम अस्थि की मरंमत के लिए पूर्व नैदानिक के लिए एक multidisciplinary रणनीति के साथ-साथ गैर-चिकित्सीय असंगति परीक्षण प्रस्तुत करता है ।
बड़े गैर संघ अस्थि भंग आर्थोपेडिक सर्जरी में एक महत्वपूर्ण चुनौती है । हालांकि ऑटो और allogeneic हड्डी भ्रष्टाचार इस तरह के घावों के उपचार के लिए उत्कृष्ट हैं, उनके उपयोग के साथ संभावित जटिलताओं हैं । इस प्रकार, सामग्री वैज्ञानिक इन समस्याओं को दूर करने के लिए सिंथेटिक, संगत सामग्री विकसित कर रहे हैं । इस अध्ययन में, हम हड्डी की मरंमत के लिए एक multidisciplinary मंच के मूल्यांकन के लिए सामग्री प्रस्तुत करते हैं । हम अस्थि जीवविज्ञान और इम्यूनोलॉजी से विशेषज्ञता संयुक्त करने के लिए सहित इन विट्रो अस्थिशोषक (OC) और osteoblast (ओबी) परख में एक मंच विकसित करने के लिए और vivo में हड्डी की मरंमत के माउस मॉडल, immunogenicity, और allergenicity । हम प्रदर्शन कैसे प्रयोग करने के लिए, परिणाम संक्षेप, और पर रिपोर्ट करने के लिए सामग्री विशेष रूप से, हम β-tricalcium फॉस्फेट (β-TCP) डिस्क के संदर्भ में ओबी व्यवहार्यता, विभेद, और mineralization और ओसी व्यवहार्यता और भेदभाव का परीक्षण किया । हम यह भी परीक्षण एक β-tcp/कोलेजन (β-tcp/C) फोम जो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हड्डी की मरंमत के लिए नैदानिक एक महत्वपूर्ण आकार calvarial हड्डी दोष माउस मॉडल में अस्थि चिकित्सा के प्रारंभिक चरण पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया सामग्री है । समानांतर प्रयोगों में, हम प्रतिरक्षा और चूहों में एलर्जी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया. हमारे दृष्टिकोण अस्थि चिकित्सा और रोगियों में मरंमत के लिए इस्तेमाल किया जैव सामग्री की असंगति की भविष्यवाणी के लिए आवश्यक मानकों की एक सीमा के साथ एक हड्डी के एक जैविक अनुकूलता प्रोफ़ाइल उत्पंन करता है ।
अस्थि मरंमत एक जटिल प्रक्रिया है कि रक्तगुल्म गठन, सूजन, घट्टा गठन के साथ शुरू होता है और फिर remodeling1,2है । हालांकि, अस्थि पुनर्जनन क्षमता हड्डी फ्रैक्चर1,3के आकार तक ही सीमित है । उदाहरण के लिए, आघात, कैंसर या ऑस्टियोपोरोसिस की वजह से बड़ी हड्डी फ्रैक्चर ठीक नहीं हो सकता है और गैर संघ हड्डी भंग हो जाता है । इन अस्थि घावों अक्सर उपचार की आवश्यकता को बढ़ावा देने के लिए स्वस्थ शारीरिक हड्डी की मरंमत और पुनर्जनन । वर्तमान में, भ्रष्टाचार और allograft हड्डी ट्रांसप्लांटेशन5की २,२००,००० अस्थि प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के साथ पसंद4 के दृष्टिकोण है । हालांकि इन प्रक्रियाओं को एक उच्च सफलता दर है, वहां जटिलताओं हो सकता है, उदाहरण के लिए, अस्थि की सीमित उपलब्धता, संक्रमण, दाता साइट रुग्णता, और अस्वीकृति4. अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए नए विकल्प इन चुनौतियों का पता मांगा जा रहा है ।
प्राकृतिक या सिंथेटिक पॉलिमर, चीनी मिट्टी की चीज़ें या कोशिकाओं और सक्रिय अणुओं के साथ संयोजन में धातुओं के आधार पर सामग्री के डिजाइन वृद्धि6पर है । हमारे शारीरिक हड्डी हीलिंग और भौतिक चिकित्सा के संदर्भ में उपचार के वर्तमान समझ यांत्रिक गुणों और कई स्थानीय और संचलन और फ्रैक्चर साइट 7 से कोशिकाओं सहित प्रणालीगत कारकों के रूप में कई कारकों पर निर्भर करता है ,8,9. अस्थि पुनर्जनन उद्देश्य के लिए osteogenicity और osseointegration10 को बढ़ावा देने के लिए और आदर्श रूप से, संगत biodegradable, और छिद्रित (सेल प्रवास, ऑक्सीजन को बढ़ावा देने, और पोषक तत्वों) । वे भी दर्द को राहत देने के लिए फ्रैक्चर साइट का समर्थन करने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत होने की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, भड़काऊ कारकों चिकित्सा प्रक्रिया शुरू करने के लिए आवश्यक हैं । हालांकि, अगर अत्यधिक सूजन और एलर्जी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं, यह सीमा या अस्थि चिकित्सा बाधित11,12हो सकता है । इस प्रकार, एक अनुशासनात्मक दृष्टिकोण के लिए अस्थि की मरंमत के लिए विकसित की है कि भौतिक मूल्यांकन आवश्यक है ।
इस अध्ययन में, हम एक पूर्व प्रतिनिधि सामग्री के नैदानिक मूल्यांकन, 1) Orthovita Vitoss फोम जो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रद्द हड्डी भ्रष्टाचार tricalcium फॉस्फेट नैनोमीटर की रचना से मिलकर विकल्प है-शुद्ध β-tricalcium फॉस्फेट (β-tcp) कणों और प्रकार 1 गोजातीय कोलेजन (c) (β-tcp/c फोम) और 2) β-tcp डिस्क. यहां, हम इन के लिए प्राथमिक osteoblast (ओबी) और अस्थिशोषक (OC) परख, का उपयोग कर इन भौतिकता की संगतता परीक्षण उदाहरण देकर स्पष्ट करना, एक vivo में हड्डी की मरंमत के मॉडल, एक प्रतिरक्षा आकलन में शामिल इन विट्रो टी लिम्फोसाइट प्रसार और cytokine उत्पादन, और vivo immunogenicity और allergenicity में, के रूप में पहले13की रिपोर्ट ।
यहां, हम अस्थि पुनर्जनन और मरंमत के लिए विकसित प्रतिनिधि के लिए एक multidisciplinary दृष्टिकोण के लिए प्रतिसंगत है । हम OBs, OCs की प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया, और में vivo उपचार प्रतिक्रिया में चूहों में एक महत्वपू…
The authors have nothing to disclose.
इस अनुसंधान परियोजना को अनुदान समझौता सं २६३३६३ के तहत यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से धन प्राप्त हुआ है ।
Biomaterials | |||
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) | Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures. | ||
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) | Orthovita | 2102-1405 | |
Mouse osteoblast culture | |||
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 | Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10. | ||
Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin | ||
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate | Thermo Scientific | C7027 | Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. |
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
Collagenase type IV from clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
DC protein assay kit II | Bio Rad | 5000112 | DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Steril-filter DMSO before usage. |
Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C9002 | |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
MEM alpha medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
Osteogenic mineralization medium (MM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate | ||
Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
Wash buffer | Add 0.05% Tween20 to 1x PBS. | ||
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G5422 | |
24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
96-well black plate | Greiner bio-one | 655076 | |
96-well transparent plate | Greiner bio-one | 655001 | |
Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | For sterile filtration of enzyme solution. |
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL | VWR | 20901-505 | |
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL | VWR | 21008-959 | |
Shaker Swip (orbital and horizontal) | Edmund Buehler | ||
Shaking incubator GFL3032 | GFL | 3032 | |
Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps) | |||
Tissue culture plate (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture | |||
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%) |
Acetone | VWR Chemicals | 22065.327 | |
Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin | ||
Distilled water | Carl Roth | 3478.4 | |
Ethanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Fast red violet LB salt | Sigma-Aldrich | F3381 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
MEM alpha Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Sigma-Aldrich | N4875 | |
Osteoclast differentiation medium (DM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 | ||
Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%) |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
Sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S8640 | |
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel) | |||
TRAP buffer pH 5.0 | Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5. | ||
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) | Buehler | ||
Isomet low-speed saw | Buehler | ||
Petri dish (6 cm) | Greiner bio-one | 628,161 | |
Screw cap glass bottle 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340 | |
Mouse calvarial defect model | |||
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) | Fresenius Kabi | ||
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
Sterile disposable scalpel (Figur 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 16929000 | |
Handpiece type S-II | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 30056000 | |
Trephine, diameter 4 mm | Hager&Meisinger GmbH | 229040 | |
Irrigation tubing set 2.2 m | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 4363600 | |
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
In vitro immune responses | |||
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit | Sigma-Aldrich | 11647229001 | The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. |
Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
Culture medium splenocytes | RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids | ||
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15750037 | |
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
Non-essential amino acids solution | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
RPMI 1640 medium, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
96-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
Cell strainer 40 µm | BD Bioscience | 352340 | |
Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides) | |||
High throughput intraperitoneal model | |||
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | For differential cell count. |
Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
Hemocytometer: Neubauer chamber | Carl Roth | PC72.1 | |
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
Resorbable suture: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
Shandon centrifuge for cytopsin | Thermo Scientific | ||
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
Trypan blue solution 0.4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Subchronic subcutaneous model | |||
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 |