Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse
Summary
Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.
Abstract
Fractures osseuses importantes de non syndiqués sont un défi en chirurgie orthopédique. Bien qu’auto – et greffe osseuse allogénique est excellente pour la guérison des lésions, il y a des complications potentielles à leur utilisation. Ainsi, matériels scientifiques mettent au point des biomatériaux synthétiques, biocompatibles pour résoudre ces problèmes. Dans cette étude, nous présentons une plateforme multidisciplinaire pour l’évaluation de biomatériaux pour la réparation osseuse. Nous avons combiné expertise biologie osseuse et d’immunologie de développer une plate-forme y compris in vitro ostéoclastes (OC) et dosages des ostéoblastes (OB) et in vivo de modèles murins de la réparation osseuse, immunogénicité et d’allergénicité. Nous montrent comment réaliser les expériences, résument les résultats et rapport sur la biocompatibilité de biomatériau. En particulier, nous avons testé la viabilité de l’OB, la différenciation et minéralisation et viabilité OC et différenciation dans le contexte des disques de β-tricalcium phosphate (β-TCP). Nous avons aussi testé une mousse (β-TCP/C) de β-TCP/collagène qui est un matériau disponible dans le commerce, utilisé en clinique pour la réparation osseuse dans un modèle murin de taille critique de substance osseuse défaut pour déterminer les effets sur la première phase de cicatrisation osseuse. Dans des expériences parallèles, nous avons évalué les réponses immunitaires et allergiques chez les souris. Notre approche génère un profil de compatibilité biologique d’un biomatériau osseux avec une gamme de paramètres nécessaires pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la guérison osseuse et la réparation chez les patients.
Introduction
La réparation osseuse est un processus complexe qui commence par la formation d’un hématome, une inflammation, Cal formation et remodelage puis1,2. Toutefois, le potentiel de régénération osseuse est limité à la taille de l’OS fracture1,3. Par exemple, les fractures des os grand causées par un traumatisme, le cancer ou l’ostéoporose ne peuvent pas guérir et sont appelées fractures osseuses non syndiqués. Ces lésions osseuses nécessitent souvent des traitements pour promouvoir la régénération et la réparation osseuse physiologique sain. Actuellement, autogreffe et allogreffe osseuse transplantation est l’approche de choix4 avec les procédures de remplacement des OS 2,2 millions par an5. Bien que ces procédures ont un taux de réussite élevé, il peut y avoir des complications, par exemple, la disponibilité limitée des os, infection, morbidité du site donneur et rejet4. De nouvelles alternatives pour l’ingénierie tissulaire osseuse sont recherchés pour relever ces défis.
La conception des biomatériaux à base de polymères naturels ou synthétiques, des biocéramiques ou des métaux en combinaison avec les cellules et molécules bioactives est sur l’ élévation6. Notre compréhension actuelle des os physiologiques de guérison et de guérison dans le contexte des biomatériaux dépend de divers facteurs tels que les propriétés mécaniques et de multiples facteurs les et systémiques, y compris les cellules de la circulation et le site de fracture7 ,8,9. Biomatériaux pour la régénération osseuse vise à promouvoir les osteogenicity et ostéointégration10 et est idéalement biocompatible et biodégradable poreux (promotion de nutriments, l’oxygène et la migration cellulaire). Ils doivent également être suffisamment solide pour supporter le site fracture pour soulager la douleur. En outre, des facteurs inflammatoires sont tenus d’engager le processus de guérison. Toutefois, si le biomatériau induit une inflammation excessive et réactions allergiques, cela pourrait limiter ou inhiber l’OS guérison11,12. Ainsi, une approche interdisciplinaire est nécessaire pour évaluer les biomatériaux destinés à la réparation osseuse.
Dans cette étude, nous présentons une évaluation préclinique de matières représentatives, 1) Orthovita Vitoss mousse qui est un substitut de greffe disponible dans le commerce d’os spongieux consistant en phosphate tricalcique composée de taille nanométrique pur β tricalcique les particules de phosphate (β-TCP) et collagène bovin de Type 1 (C) (β-TCP/C mousse) et 2) des disques de β-TCP. Ici, nous illustrons test de biocompatibilité de ces biomatériaux à l’aide des ostéoblastes primaires (OB) et dosages des ostéoclastes (OC), un modèle in vivo de la réparation osseuse, une évaluation immunologique comprenant in vitro la prolifération des lymphocytes T et la production de cytokines et in vivo de l’immunogénicité et l’allergénicité, comme indiqué précédemment13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous montrons une approche multidisciplinaire pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des biomatériaux représentatif mis au point pour la réparation et la régénération osseuse. Nous avons testé les réponses de l’OBs, OCs, et la réponse de guérison in vivo dans un défaut critique OS modèle de souris ainsi que in vitro et in vivo des réponses immunitaires. L’étude visait à démontrer comment les tests fonctionnent et résument les données et les conclusi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet de recherche a reçu financement du septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) de l’Union européenne au titre de la subvention contrat no 263363.
Materials
| Biomaterials | |||
| β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) | Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures. | ||
| Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Mouse osteoblast culture | |||
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| ALP assay buffer (2x) pH 10.4 | Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10. | ||
| Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin | ||
| Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate | Thermo Scientific | C7027 | Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. |
| Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Collagenase type IV from clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DC protein assay kit II | Bio Rad | 5000112 | DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Steril-filter DMSO before usage. |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM alpha medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| Osteogenic mineralization medium (MM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate | ||
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
| Wash buffer | Add 0.05% Tween20 to 1x PBS. | ||
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| 24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-well black plate | Greiner bio-one | 655076 | |
| 96-well transparent plate | Greiner bio-one | 655001 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
| Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | For sterile filtration of enzyme solution. |
| Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
| Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL | VWR | 20901-505 | |
| Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (orbital and horizontal) | Edmund Buehler | ||
| Shaking incubator GFL3032 | GFL | 3032 | |
| Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps) | |||
| Tissue culture plate (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Mouse osteoblast-osteoclast co-culture | |||
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%) |
| Acetone | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin | ||
| Distilled water | Carl Roth | 3478.4 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Fast red violet LB salt | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM alpha Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Osteoclast differentiation medium (DM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 | ||
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%) |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel) | |||
| TRAP buffer pH 5.0 | Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5. | ||
| Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
| 24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) | Buehler | ||
| Isomet low-speed saw | Buehler | ||
| Petri dish (6 cm) | Greiner bio-one | 628,161 | |
| Screw cap glass bottle 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340 | |
| Mouse calvarial defect model | |||
| Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) | Fresenius Kabi | ||
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile disposable scalpel (Figur 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 16929000 | |
| Handpiece type S-II | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 30056000 | |
| Trephine, diameter 4 mm | Hager&Meisinger GmbH | 229040 | |
| Irrigation tubing set 2.2 m | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 4363600 | |
| Periosteal elevator 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
| Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| In vitro immune responses | |||
| Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit | Sigma-Aldrich | 11647229001 | The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. |
| Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
| Culture medium splenocytes | RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids | ||
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15750037 | |
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Mouse INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| Non-essential amino acids solution | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| RPMI 1640 medium, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Cell strainer 40 µm | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile surgical instruments (forceps, glass slides) | |||
| High throughput intraperitoneal model | |||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | For differential cell count. |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hemocytometer: Neubauer chamber | Carl Roth | PC72.1 | |
| Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Resorbable suture: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Shandon centrifuge for cytopsin | Thermo Scientific | ||
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
| Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Subchronic subcutaneous model | |||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
Referências
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