Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.
Abstract
Studien in dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung erfordern spezialisierte Methoden. Hier untersuchten wir Veränderungen in neu synthetisierten Proteine als Reaktion auf Ischämie und Reperfusion mit isoliert PERFUNDIERTEN Maus Herzen gepaart mit Polysome Profilierung. Um die dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung besser zu verstehen, wir zeichnen die mRNAs, die wurden mit cytosolische Ribosomen (Polyribosomes oder Polysomes) geladen und auch erholt mitochondriale Polysomes und verglichen mRNA und Protein-Verteilung in der Hocheffizienz Fraktionen (zahlreiche Ribosomen an mRNA befestigt), niedrig-Effizienz (weniger Ribosomen befestigt) darunter auch mitochondriale Polysomes und die Fraktionen nicht übersetzen. MiRNAs können auch mit mRNAs, die übersetzt werden werden, wodurch die Effizienz der Übersetzung zuordnen, untersuchten wir die Verteilung der MiRNAs in die Brüche. Die Verteilung der mRNAs, MiRNAs und Proteine wurde unter basalen PERFUNDIERTEN Bedingungen am Ende des 30 min des globalen keine-Flow-Ischämie und nach 30 min der Reperfusion untersucht. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden verwendet, um diese Analyse zu erreichen – unter anderem wurde der Ansatz zur Optimierung der Proteingewinnung aus Saccharose Neigung, als dies nicht vor beschrieben — und einige repräsentative Ergebnisse liefern.
Introduction
Das Herz reagiert auf die Verletzung von (I) Ischämie und Reperfusion (R) in einer dynamischen Art und Weise. Allerdings gibt es wenig Einblick in akute Veränderungen bei der Proteinsynthese während der Reaktion. Um dieses Problem anzugehen, wir nutzten die etablierte Methode der Polysome Profilierung1 zur Identifizierung von Änderungen im Protein-Überfluss, die Umverteilung von Ribosomen und Translationale regulatorische Faktoren vom Zytosol zu Polysomes, zu reflektieren und die Anstieg der neu synthetisierten Proteine (NSP). In der Umgebung von I / R, die Zunahme der neuen Protein-Synthese erfolgt in einem Zeitrahmen, die nicht übereinstimmen mit Transkription des neuen mRNAs2; Darüber hinaus wurde Discordance zwischen mRNA Ausdruck und Protein Fülle gemeldeten3. Aus diesen Gründen haben wir die Änderungen in der dynamischen Proteomforschung zu analysieren, wie Protein Übersetzung widerspiegelt. Um dies zu tun, wir mRNA in den Polysome Fraktionen zu quantifizieren, und analysieren die Proteinzusammensetzung in den Polysome Fraktionen. Schließlich, da MicroRNAs (MiRs) Verfügbarkeit von mRNAs für die Übersetzung zu regulieren und Effizienz von Protein Übersetzung4,5stören können, untersuchten wir die Verteilung der MiRs in den Polysome Fraktionen, mit Schwerpunkt auf der Antwort auf I / r.
Wir entschieden uns für die isolierten Langendorff Perfusion Mausmodell und geernteten Gewebe unter basalen Bedingungen der kontinuierliche Perfusion, nach 30 min global keine-Flow-Ischämie und nach 30 min von Ischämie, gefolgt von 30 min der Reperfusion verwenden. Wir dann solubilisiert Herzgewebe und Polysomes über einen Saccharose Gradienten getrennt gefolgt von Proteomic Analysen und selektive Detektion von mRNAs und MiRNAs durch PCR und Microarray, beziehungsweise. Diese Kombination von Methoden steht einen leistungsfähigen Ansatz zum Verständnis der dynamischen Proteom, ermöglicht simultane Detektion von mRNA und MiRNA, Nadel-, sowie die Umverteilung von regulatorischen Proteinen, MiRNA und mRNA zwischen nontranslating Brüchen, niedrige Effizienz Polysomes und Hochleistungs-Polysomes (siehe Abbildung 1). Einblicke in die dynamische Regulierung dieses Prozesses werden durch weitere Analysen der Phosphorylierung wichtige regulatorische Faktoren wie eIF2α oder mTOR verlängert werden. Diese einzelnen Schritte sind nun detailliert beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome Profilanalyse ermöglicht die Untersuchung von Protein-Übersetzung durch die Analyse von translationalen Bundesstaat eine spezifische mRNA oder die ganze Transkriptom-6,–7. Es ist auch eine große Hilfe, wenn lokale Übersetzung werden, wie z. B. Synaptosomes8 untersucht muss. Diese Methode umfasst traditionell die Trennung von Mono – und Polyribosomes und die damit verbundenen mRNAs auf einer Saccharose-Steigung welche mit genom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Frauen-Herz-Zentrum (RAG, JVE), Dorothy und E. Phillip Lyon Stuhl in Molekulare Kardiologie (RAG), Erika Glazer Stiftungslehrstuhl im Herzgesundheit der Frau (JVE) und Tschechische Akademie der Wissenschaften Institutionelle Unterstützung RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. | ||
Referências
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