Her presenterer vi en protokoll for å utføre polysome profilering på isolerte perfused musen hjertet. Vi beskriver metoder for hjertet perfusjon, polysome profilering og analyse av polysome fraksjoner med hensyn til mRNAs, miRNAs og polysome proteom.
Studier i dynamiske endringer i protein oversettelsen krever spesialiserte. Her undersøkte vi endringer i nylig syntetisert proteiner som svar på iskemi og reperfusion bruker isolert perfused musen hjertet kombinert med polysome profilering. For ytterligere å forstå de dynamiske endringene i protein oversettelsen, vi preget mRNAs som var lastet med cytosolic ribosomer (polyribosomes eller polysomes) og gjenopprettet mitokondrie polysomes og sammenlignet mRNA og protein distribusjon i den høy effektivitet brøker (mange ribosomer knyttet til mRNA), lav effektivitet (færre ribosomer vedlagt) som også inkluderte mitokondrie polysomes og ikke oversette fraksjoner. miRNAs kan også knytte til mRNAs som er oversatt, og dermed redusere effektiviteten av oversettelse, undersøkte vi distribusjon av miRNAs over fraksjoner. Distribusjon av mRNAs, miRNAs og proteiner ble undersøkt under basale perfused forhold, på slutten av 30 min global mer iskemi, og etter 30 min av reperfusion. Her presenterer vi metodene som brukes til å utføre denne analysen, spesielt tilnærmingen til optimalisering av protein utvinning fra sukrose gradient, dette har ikke vært beskrevet før- og gi noen representant resultater.
Hjertet reagerer på skaden iskemi (I) og reperfusion (R) på en dynamisk måte. Det er imidlertid inn i akutte endringer i proteinsyntese i svaret. For å løse dette, vi tok fordel av den veletablerte polysome profilering1 for å identifisere endringer i protein overflod som gjenspeiler omfordeling av ribosomer og translasjonsforskning regulatoriske forhold fra stoffer til polysomes, og økning i nylig syntetisert proteiner (sprøytebytteprogrammene). I innstillingen for I / R, økningen i nye proteinsyntese oppstår i et tidsrom som er uforenlig med transkripsjon av nye mRNAs2; Videre har discordance mellom mRNA uttrykk nivåer og protein overflod vært rapportert3. For disse grunner valgte vi å analysere endringer i den dynamiske proteom slik protein oversettelsen. Dette gjør vi kvantifisere mRNA i polysome fraksjoner, og analysere protein sammensetningen i polysome fraksjoner. Til slutt, fordi microRNAs (miRs) regulere tilgjengelighet av mRNAs for oversettelse og kan påvirke effektiviteten av protein oversettelsen4,5, undersøkte vi distribusjon av miRs i polysome fraksjoner, med fokus på den svar jeg / R.
Vi valgte å bruke isolert mus Langendorff perfusjonsmåler modell og høstet vev under basale forhold av kontinuerlig perfusjon, etter 30 min global mer iskemi, og etter 30 min av iskemi etterfulgt av 30 min av reperfusion. Vi solubilized hjertet tissue og atskilt polysomes over sukrose gradering, etterfulgt av proteomic analyse og selektiv deteksjon av mRNAs og miRNAs av PCR og microarray, henholdsvis. Denne kombinasjonen av metoder representerer en effektiv tilnærming til å forstå den dynamiske proteom, aktivere samtidig påvisning av mRNA, miRNA, og sprøytebytteprogrammer og omfordeling av regulatoriske proteiner og miRNA mRNA mellom nontranslating fraksjoner, lav effektivitet polysomes og høy effektivitet polysomes (se figur 1). Innsikt i dynamiske regulering av denne prosessen vil utvides ytterligere analyse av fosforylering viktige forskrifter faktorer som eIF2α eller mTOR. Disse individuelle trinnene er nå beskrevet i detalj.
Polysome profil analyse muliggjør studiet av protein oversettelsen av analysering translasjonsforskning statusen for en bestemt mRNA eller hele transcriptome6,7. Det er også til stor hjelp når lokale oversettelse må studeres som synaptosomes8. Denne metoden innebærer tradisjonelt, separasjon av mono – og polyribosomes og de tilhørende mRNAs sukrose gradering som kan kombineres med genomisk eller proteomic teknikker for å få resulta…
The authors have nothing to disclose.
NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE) Barbra Streisand kvinners hjertet Senter (RAG, JVE), Dorothy og E. Phillip Lyon stol i molekylær kardiologi (RAG), Erika Glazer utstyrt stol i kvinnens hjerte helse (JVE) og tsjekkiske vitenskapsakademi Institusjonell støtte RVO: 68081715 (MS).
Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |