Динамический протеомных и Мирна анализ Polysomes от изолированных мыши сердца после Langendorff перфузии
Summary
Здесь мы представляем протокол для выполнения профилирования на изолированной перфузии мыши сердце Полисома. Мы описываем методы перфузия сердца, Полисома профилирования и анализа Полисома фракций в отношении мРНК, адаптивной и Полисома протеома.
Abstract
Исследования в динамических изменений в переводе белка требуют специальных методов. Здесь мы рассмотрели изменения в недавно синтезированных белков в ответ ишемии и реперфузии, используя изолированной перфузии мыши сердце, в сочетании с Полисома профилирования. Для более глубокого понимания динамических изменений в переводе белка, мы характеризуется мРНК, которые были загружены с цитозольной рибосом (полирибосомы или polysomes) и также восстановлены митохондриальной polysomes и сравнили мРНК и белка распределения в высокая эффективность дроби (многочисленные прилагается к мРНК рибосомы), низкий эффективность (меньше рибосомы прилагается) которая также включала митохондриальных polysomes и -перевод дробей. интерферирующим можно также связать с мРНК, которые переводятся, тем самым снижая эффективность перевода, мы исследовали распределение адаптивной различных фракций. Распределение мРНК, адаптивной и белков был рассмотрен условиях базальной перфузии, в конце 30 мин глобальной ишемии потока нет и после 30 минут реперфузии. Здесь мы представляем методы, используемые для выполнения такого анализа — в частности, не был описан подход к оптимизации добычи белка из сахарозы градиента, как это раньше — и предоставить некоторые представитель результаты.
Introduction
Сердце реагирует к ушибу ишемии (I) и реперфузии (R) в динамических моды. Однако есть меньшюю проницательность в острой изменения в синтезе белков во время ответа. Для решения этой проблемы, мы воспользовались устоявшихся метода профилирования1 для выявления изменений в изобилии белков, которые отражают перераспределение рибосомы и трансляционная регуляторные факторы от цитозоль для polysomes, Полисома и увеличение вновь синтезируемых белков (ПСУ). В обстановке я / R, увеличение синтеза новых белков происходит в сроки, что является несовместимым с транскрипцией новой мРНК2; Кроме того отсутствие согласованности между уровнями выражение mRNA и изобилие белка был сообщил3. По этим причинам мы решили проанализировать изменения в динамических протеома как отражение переводом белка. Чтобы сделать это, мы количественно мРНК в Полисома фракций и анализировать состав белка в Полисома фракции. Наконец, потому что микроРНК (Мирс) регулирования доступности мРНК для перевода и может мешать эффективности белка перевод4,5, мы исследовали распределение Мирс в Полисома фракций, сосредоточив внимание на ответ на я / R.
Мы решили использовать модель изолированных мыши Langendorff перфузии и заготовленной ткани в базальных условиях непрерывной перфузии, после 30 мин глобального потока нет ишемии и после 30 минут ишемии, следуют 30 мин реперфузии. Затем мы солюбилизирован ткани сердца и разделенные polysomes над градиентом сахарозы, следуют протеомного анализа и селективного выявления мРНК и адаптивной ПЦР и microarray дна, соответственно. Это сочетание методов представляет собой мощный подход к пониманию динамический протеом, позволяя одновременного обнаружения мРНК, Мирна, и Энни, а также перераспределения регуляторных белков, Мирна и мРНК nontranslating фракции, низкая эффективность polysomes и polysomes высокой эффективности (см. Рисунок 1). Понимание динамического регулирования этого процесса будет расширен путем дальнейшего анализа фосфорилирования ключевых регулирующих факторов, таких как eIF2α или mTOR. Теперь эти отдельные шаги описаны в деталях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Полисома профиль анализ позволяет для изучения белков перевода, анализируя состояние трансляционная конкретные мРНК или весь транскриптом6,7. Это также большую помощь, когда местные перевода необходимо изучить такие синаптосомах8. Традицио…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P01 низ HL112730 (тряпка, JVE), низ R01 HL132075 (тряпка, JVE), центр сердца женщин Барбра Стрейзанд (тряпка, JVE), Дороти и э. Филипп Лион стул в молекулярной кардиологии (ветошь), Эрика Глейзер наделены стул в женском здоровье сердца (JVE) и Чешской академии наук Институциональная поддержка РВО: 68081715 (МС).
Materials
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. | ||
Referências
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M., Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R., Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
