Здесь мы представляем протокол для выполнения профилирования на изолированной перфузии мыши сердце Полисома. Мы описываем методы перфузия сердца, Полисома профилирования и анализа Полисома фракций в отношении мРНК, адаптивной и Полисома протеома.
Исследования в динамических изменений в переводе белка требуют специальных методов. Здесь мы рассмотрели изменения в недавно синтезированных белков в ответ ишемии и реперфузии, используя изолированной перфузии мыши сердце, в сочетании с Полисома профилирования. Для более глубокого понимания динамических изменений в переводе белка, мы характеризуется мРНК, которые были загружены с цитозольной рибосом (полирибосомы или polysomes) и также восстановлены митохондриальной polysomes и сравнили мРНК и белка распределения в высокая эффективность дроби (многочисленные прилагается к мРНК рибосомы), низкий эффективность (меньше рибосомы прилагается) которая также включала митохондриальных polysomes и -перевод дробей. интерферирующим можно также связать с мРНК, которые переводятся, тем самым снижая эффективность перевода, мы исследовали распределение адаптивной различных фракций. Распределение мРНК, адаптивной и белков был рассмотрен условиях базальной перфузии, в конце 30 мин глобальной ишемии потока нет и после 30 минут реперфузии. Здесь мы представляем методы, используемые для выполнения такого анализа — в частности, не был описан подход к оптимизации добычи белка из сахарозы градиента, как это раньше — и предоставить некоторые представитель результаты.
Сердце реагирует к ушибу ишемии (I) и реперфузии (R) в динамических моды. Однако есть меньшюю проницательность в острой изменения в синтезе белков во время ответа. Для решения этой проблемы, мы воспользовались устоявшихся метода профилирования1 для выявления изменений в изобилии белков, которые отражают перераспределение рибосомы и трансляционная регуляторные факторы от цитозоль для polysomes, Полисома и увеличение вновь синтезируемых белков (ПСУ). В обстановке я / R, увеличение синтеза новых белков происходит в сроки, что является несовместимым с транскрипцией новой мРНК2; Кроме того отсутствие согласованности между уровнями выражение mRNA и изобилие белка был сообщил3. По этим причинам мы решили проанализировать изменения в динамических протеома как отражение переводом белка. Чтобы сделать это, мы количественно мРНК в Полисома фракций и анализировать состав белка в Полисома фракции. Наконец, потому что микроРНК (Мирс) регулирования доступности мРНК для перевода и может мешать эффективности белка перевод4,5, мы исследовали распределение Мирс в Полисома фракций, сосредоточив внимание на ответ на я / R.
Мы решили использовать модель изолированных мыши Langendorff перфузии и заготовленной ткани в базальных условиях непрерывной перфузии, после 30 мин глобального потока нет ишемии и после 30 минут ишемии, следуют 30 мин реперфузии. Затем мы солюбилизирован ткани сердца и разделенные polysomes над градиентом сахарозы, следуют протеомного анализа и селективного выявления мРНК и адаптивной ПЦР и microarray дна, соответственно. Это сочетание методов представляет собой мощный подход к пониманию динамический протеом, позволяя одновременного обнаружения мРНК, Мирна, и Энни, а также перераспределения регуляторных белков, Мирна и мРНК nontranslating фракции, низкая эффективность polysomes и polysomes высокой эффективности (см. Рисунок 1). Понимание динамического регулирования этого процесса будет расширен путем дальнейшего анализа фосфорилирования ключевых регулирующих факторов, таких как eIF2α или mTOR. Теперь эти отдельные шаги описаны в деталях.
Полисома профиль анализ позволяет для изучения белков перевода, анализируя состояние трансляционная конкретные мРНК или весь транскриптом6,7. Это также большую помощь, когда местные перевода необходимо изучить такие синаптосомах8. Традицио…
The authors have nothing to disclose.
P01 низ HL112730 (тряпка, JVE), низ R01 HL132075 (тряпка, JVE), центр сердца женщин Барбра Стрейзанд (тряпка, JVE), Дороти и э. Филипп Лион стул в молекулярной кардиологии (ветошь), Эрика Глейзер наделены стул в женском здоровье сердца (JVE) и Чешской академии наук Институциональная поддержка РВО: 68081715 (МС).
Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |