Dans cet article, nous fournissons qu’un protocole détaillé pour l’expression des protéines de fusion fluorescent murin de moelle osseuse provenant des macrophages et les cellules dendritiques. La méthode est basée sur la transduction de la moelle osseuse progéniteurs avec constructions retroviral suivies de différenciation en macrophages et dendritiques des cellules in vitro.
Les macrophages et les cellules dendritiques sont des cellules cruciales qui forment la première ligne de défense contre les agents pathogènes. Ils jouent également un rôle important dans le déclenchement d’une réponse immunitaire adaptative. Des travaux expérimentaux avec ces cellules sont plutôt difficile. Leur abondance dans les organes et les tissus est relativement faible. Ainsi, ils ne peuvent pas être isolés en grand nombre. Ils sont également difficiles à transfecter constructions d’ADNc. Dans le modèle murin, ces problèmes peuvent être partiellement résolus par in vitro la différenciation des progéniteurs de la moelle osseuse en présence de M-CSF pour les macrophages ou GM-CSF pour les cellules dendritiques. De cette façon, il est possible d’obtenir de grandes quantités de ces cellules de très peu d’animaux. En outre, les cellules souches de la moelle osseuse peuvent être transduites avec des vecteurs rétroviraux transportant des constructions de l’ARNC durant les premiers stades de la culture avant leur différenciation dans la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages. Ainsi, transduction rétrovirale, suivie par la différenciation in vitro peut être utilisée pour exprimer les diverses constructions de cDNA dans ces cellules. La capacité d’exprimer les protéines ectopiques considérablement élargit sa gamme d’expériences qui peuvent être effectuées sur ces cellules, y compris l’imagerie de cellules vivantes de protéines fluorescentes, des purifications en tandem pour les analyses de l’interactome, analyses de la structure-fonction, le contrôle des fonctions cellulaires avec biocapteurs et bien d’autres. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour la transduction rétrovirale du murin de la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages avec vecteurs codant pour des protéines fluorescent-étiquetées. L’exemple de deux protéines d’adaptateur, OPAL1 et PSTPIP2, nous démontrons son application pratique en cytométrie en flux et en microscopie. Nous discuterons les avantages et les limites de cette approche.
Cellules myéloïdes représentent un élément indispensable de nos mécanismes de défense contre les agents pathogènes. Ils sont capables d’éliminer rapidement les microbes, mais aussi les cellules mourantes. En outre, ils sont également impliqués dans la régulation de réparation et développement des tissus et dans le maintien de l’homéostasie du1,2,3. Toutes les cellules myéloïdes différencient des progéniteurs myéloïdes communs dans la moelle osseuse. Leur différenciation en plusieurs sous-ensembles distincts morphologiquement et fonctionnellement est largement contrôlée par les cytokines et leurs diverses combinaisons4. Les sous-ensembles de cellules myéloïdes plus intensivement étudiés incluent les granulocytes neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques. Défauts dans l’une de ces populations mènent à des conséquences potentiellement mortelles et cause de graves dysfonctionnements du système immunitaire chez l’homme et la souris1,2,3,5, 6.
À la différence des granulocytes neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques sont des cellules résidentes des tissus et leur abondance dans les organes du système immunitaire est relativement faible. Ainsi, l’isolation et la purification de cellules dendritiques primaires et les macrophages pour les expériences nécessitant un grand nombre de ces cellules est coûteux et souvent impossible. Pour résoudre ce problème, les protocoles ont été développés afin d’obtenir de grandes quantités de homogènes macrophages ou cellules dendritiques in vitro. Ces approches sont basées sur la différenciation des cellules de la moelle épinière murine en présence de cytokines : and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) pour les macrophages et le facteur stimulant les colonies de granulocytes et macrophages (GM-CSF) ou Flt3 ligand pour les cellules dendritiques7,8,9,10,11,12. Cellules générées par cette méthode sont couramment décrits dans la littérature, comme la moelle osseuse provenant des macrophages (BMDMs) et dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs). Elles ont des propriétés physiologiques plus en commun avec le primaires macrophages ou cellules dendritiques qu’avec des lignées de cellules correspondantes. Un autre avantage majeur est la possibilité d’obtenir ces forment des cellules génétiquement modifiées souris13. Études de comparatif entre les cellules de type sauvage et cellules dérivées des souris génétiquement modifiées sont souvent essentiels pour découvrir nouvelles fonctions des gènes ou des protéines d’intérêt.
Analyse de localisation sous-cellulaire des protéines dans les cellules vivantes exige que l’accouplement d’un label fluorescent à la protéine d’intérêt in vivo. Ceci est plus souvent réalisé en exprimant construct génétiquement encodé fusion composé d’une protéine analysée couplée (souvent via un linker court) à une protéine fluorescente (e.g., green fluorescent protein (GFP))14,15 , 16. il est difficile de l’expression des protéines fluorescent étiquetées dans les cellules dendritiques ou les macrophages. Ces cellules sont généralement difficiles à transfecter de procédures standard de transfection et l’efficacité ont tendance à être très faible. En outre, la transfection est transitoire, il génère le stress cellulaire et atteints d’intensité de la fluorescence pourrait ne pas suffire pour microscopie17. Afin d’obtenir une fraction raisonnable de ces cellules avec un niveau suffisant d’expression du transgène, l’infection des cellules souches de la moelle osseuse avec retroviral vecteurs et leur différenciation ultérieure en BMDMs ou BMDCs est devenu un très efficace approche. Il a laissé pour l’analyse des protéines d’origine myéloïde dans leur environnement natif de cellulaire, aussi bien dans un état stable ou au cours de processus qui sont essentiels pour le système immunitaire comme la phagocytose, la formation des synapses immunologiques ou la migration. Nous décrivons ici un protocole qui permet l’expression stable des protéines fluorescent étiquetés d’intérêt dans les macrophages murins médullaire dérivé et les cellules dendritiques.
L’expression de la protéine d’intérêt dans les cellules cibles est une étape clé dans plusieurs types d’études biologiques. Différenciées des macrophages et les cellules dendritiques sont difficiles à transfecter par transfection standard et des techniques de transduction rétrovirale. Contournant la transfection des cellules différenciées avec retroviral transduction des ancêtres de moelle, suivie de différenciation lorsqu’ils portent déjà la construction désirée, est une étape cruciale permett…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par Science de tchèque Foundation (GACR) (numéro de projet : 16-07425S), par Charles Université Grant Agence (GAUK) (numéro du projet 923116) et par un financement institutionnel de l’Institut de génétique moléculaire de l’Académie des Sciences de la République tchèque République (RVO 68378050).
DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |