In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência
Summary
Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.
Abstract
Em resposta à invasão de patógenos, os neutrófilos liberar neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), que são redes extracelulares de DNA decorado com histonas e proteínas antimicrobianas. Formação excessiva de líquido (NETosis) e liberação de citH3 durante a sepse está associada a vários órgãos e mortalidade em ratos e seres humanos, mas suas implicações em cães são desconhecidas. Aqui, descrevemos uma técnica para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro para observação e quantificação de NETosis. Plasma rico em leucócitos, gerado pela sedimentação de dextrano, é separado por meios de separação gradiente de densidade comercialmente disponíveis e granulócitos coletados para contagem e testes de viabilidade celular. Para observar em tempo real NETosis em neutrófilos ao vivo, celular permeant e celular impermeant fluorescente do ácido nucleico manchas são adicionadas ao neutrófilos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) ou phorbol myristate 12 13-acetato (PMA). Alterações na morfologia nuclear e formação líquida são observadas ao longo do tempo por microscopia de fluorescência. In vitro NETosis caracteriza-se ainda mais por co-colocalization do DNA de células livres (cfDNA), mieloperoxidase (MPO) e citrulinado histona H3 (citH3) usando um protocolo duplo-encontrava modificado. Para quantificar objectivamente formação líquida e citH3 expressão usando microscopia de fluorescência, redes e células citH3-positivo são quantificadas de forma cega usando software disponível. Esta técnica é um ensaio específico para avaliar em vitro capacidade dos neutrófilos caninos para submeter-se NETosis.
Introduction
Os neutrófilos são granulócitos curta duração responsáveis para a defesa inicial contra invasão de agentes patogénicos. Neutrófilos, recrutados para o local da infecção, eliminam microorganismos pela fagocitose, degranulação e geração de oxigênio reativo espécies (ROS)1. Na presença de bactérias ou Endotoxinas, neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), composto de cromatina extracelular decorado com histonas e granulares proteínas como elastase e mieloperoxidase (MPO)2. Embora os NETs têm propriedades antimicrobianas indispensáveis, aumentar as evidências experimentais e clínicas sugere que excesso de zelo formação líquida durante a sepse pode levar a vários órgãos disfunção e morte3,4, 5 , 6.
Porque redes podem desempenhar um papel fisiopatológico semelhante em cães, intervenções terapêuticas que impedem ou diminuem a formação de líquido podem servir como estratégias de tratamento romance em animais sépticos. Por esta razão, há uma necessidade de uma técnica confiável avaliar e quantificar os componentes líquidos em cães e NETosis. NET componentes incluindo DNA sem célula (cfDNA) e os nucleossomas anteriormente foram avaliadas em neutrófilos caninos e plasma de cães clínico7,8,9. Utilizando ensaios de fluorescência, Goggs e Letendre encontraram que cães sépticos têm níveis mais elevados de cfDNA que cães saudáveis8. Embora essas técnicas sejam altamente objetiva e quantitativa, medição de cfDNA e os nucleossomas como marcadores de NETosis é específico já que eles podem ser derivados de células necróticas diferente NETosing neutrófilos. Aqui nós descrevemos uma técnica que utiliza a microscopia de fluorescência para examinar os comportamentos dos neutrófilos de NETosing ao vivo. Também detalhamos um protocolo modificado usando duplo-immunolabeling para quantificar subjetivamente redes e seus componentes como MPO e citH3 em canino neutrófilos10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos aqui um protocolo para observar as alterações no lançamento de conformação e cfDNA núcleos na vida canina neutrófilos usando um corante permeant célula e um corante impermeant célula. A principal vantagem deste teste é que ela permite detecção em tempo real de formação líquida por microscopia de alta resolução em neutrófilos ao vivo sem fixação da pilha, portanto, fornecendo uma ferramenta simples e valiosa para a observação em vitro NET formação. Desde que este ensaio não r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor correspondente foi financiado pela Morris Animal Foundation (D15CA-907). O estudo foi apoiado por fundos da Universidade da Califórnia, Davis, centro de saúde de equinos e centro de saúde de animais de companhia (2016-24-F). Os autores gostaria de reconhecer Geena Ng pela sua assistência com as figuras e Nghi Nguyen pela sua assistência com o vídeo.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
Referências
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