In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (T_HGM)-Helferzellen von naiven CD4 + T-Zellen, einschließlich Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen, Differenzierung von T_HGM, zu differenzieren und Analyse von differenzierten Zellen T_HGM. Diese Methode kann auf Studien der Verordnung und Funktion von T_HGM Zellen angewendet werden.

Abstract

Der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF)-Herstellung von T-Helfer (T_HGM)-Zelle ist eine neu identifizierten T Helfer Zelle Teilmenge, die überwiegend sondert GM-CSF ohne Herstellung von Interferon (IFN) γ oder Interleukin (IL)-17 und wird festgestellt, dass Spielen Sie eine wesentliche Rolle in der autoimmunen Neuroinflammation. Eine Methode zur Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen aus einer einzelligen Aussetzung der splenocyten und T_HGM Zellgeneration von naiven CD4 + T-Zellen wäre eine nützliche Technik in der Studie von T zellvermittelte Immunität und Autoimmunerkrankungen. Hier beschreiben wir eine Methode, die Maus naive CD4 + T-Zellen in T_HGM Zellen gefördert durch IL-7 unterscheidet. Das Ergebnis der Unterscheidung wurde durch die Analyse der Zytokine Ausdruck mit verschiedenen Techniken, einschließlich intrazelluläre Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie, eine quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR), beurteilt und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA). Mit dem T-_H-GM Differenzierung Protokoll wie beschrieben hier, etwa 55 % der Zellen ausgedrückt GM-CSF mit einem minimalen Ausdruck IFNα oder IL-17. Der vorherrschende Ausdruck von GM-CSF von T_HGM Zellen wurde durch die Analyse des Ausdrucks von GM-CSF, IFNα und IL-17 mRNA und Protein Ebene bestätigt. So können mit dieser Methode, naive CD4 + T-Zellen, T zu unterscheiden_HGM Zellen in Vitro, die werden in der Studie von T_HGM Zellbiologie.

Introduction

CD4 + T-Helferzellen (T_H) sind wesentliche Bestandteile des Immunsystems, da entscheidende Rollen in der Wirt Verteidigung gegen mikrobielle Krankheitserreger, in der Krebs-Überwachung, und Autoimmunität^1,2,3. Bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung naive CD4 + T-Zellen differenzieren sich in T_H1, T_H2, T_H 17 oder regulatorischen T (Treg) Zellen unter dem Einfluss von verschiedenen Zytokin Milieus^{2,4, 5}. vor kurzem eine neue Untergruppe von T_H Zellen, die überwiegend GM-CSF produziert, wurde identifiziert und benannt T_HGM⁶. Die Differenzierung der Zellen T_HGM treibt IL-7 durch die Aktivierung von einem Signalwandler und Aktivator der Transkription 5 (STAT5). Diese Zellen eine große Menge von GM-CSF zum Ausdruck bringen und dabei eine geringe Expression von anderen T-_H-Handy-Signatur Zytokine wie z. B. IFNγ und IL-17⁶. GM-CSF erwies sich als eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von CD4 + T-Zell-vermittelten Neuroinflammation^7,8. GM-CSF mit dem Ausdruck T Zellen im Vergleich zu IFNγ oder IL-17-exprimierenden autoreaktiven T-Zellen, in Wildtyp übertragen (WT) Mäusen verursacht ein früher Krankheitsbeginn und höheren Schweregrad der Erkrankung. Darüber hinaus scheiterte Csf2– / – T-Zellen induzieren Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) nach adoptively auf WT-Empfänger übertragen werden, während T-Zellen IFNγ oder IL-17A fehlt die Fähigkeit, EAE⁷vermitteln beibehalten. Darüber hinaus verbessert eine Blockade von GM-CSF mit neutralisierenden Antikörpern EAE Krankheit schwere⁸. Darüber hinaus führte ein Mangel an STAT5 in T-Zellen in Mäusen in einer verminderten T_HGM-Generation und somit in einen Widerstand von den Mäusen EAE Entwicklung⁶. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von GM-CSF mit dem Ausdruck T_H Zellen in autoimmune schwere Krankheit. So wäre eine Methode um GM-CSF mit dem Ausdruck T_H Zellen von naiven CD4 + T-Zellen zu unterscheiden in der Untersuchung der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen Neuroinflammation und T-Zell-vermittelten Immunantwort wichtig. Allerdings erzeugt ein Protokoll, das effizient T_HGM Zellen aus murinen naive CD4 + nicht etabliert hat.

Hier präsentieren wir eine Methode, die naive CD4 + T-Zellen murine T_HGM Zellen unterscheidet. Dieses Protokoll beschreibt das gesamte Verfahren, einschließlich der Entnahme der Milz von der Maus, die Vorbereitung eine einzellige Suspension, die CD4 positive Selektion, die Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die T_H Zelle Differenzierung und Analyse. Die differenzierte T-Helferzellen werden analysiert, indem intrazellulären Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie zu bestimmen, die Cytokine Ausdruck Ebene einzellige durch eine quantitative Echtzeit-PCR die Zytokin-Expression auf mRNA-Ebene zu bestimmen und von ELISA die Zytokin-Expression auf proteinebene zu bewerten. Diese Methode kann auf Studien von T_HGM Zellbiologie unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. EAE, angewendet werden, wo GM-CSF eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielt.

Protocol

Alle Mäuse, die in diesem Protokoll verwendeten waren auf den genetischen Hintergrund der C57BL/6 und unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen an der National University of Singapore untergebracht. Alle Experimente wurden durchgeführt mit Protokollen, die durch die institutionellen Animal Care and Use Committee von der National University of Singapore genehmigt. (1) Reagenz und Vorbereitung des Materials Bereiten Sie 500 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), enthäl…

Representative Results

Naive CD4 + T-Zellen, die aus zwei 8 Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen isoliert wurden in drei Teile unterteilt. Ein Teil der Zellen unterschieden wurde in THGM Zellen nach dem Protokoll beschrieben. Ein weiterer Teil wurde unter einer Bedingung THGM in Anwesenheit von Anti-IL-4 Antikörper (10 µg/mL) kultiviert, um den Einfluss einer IL-4-Blockade bei der Differenzierung von THGM zu testen. Der letzte Teil war unter einer TH17 Differenz…

Discussion

Wir beschrieben hier ein Protokoll von einer in-vitro- T_HGM Differenzierung von Maus-naive CD4 +-Zellen, gefolgt von einer Analyse der differenzierten Zellen, die Methode zu validieren. Der Hinweis Milz und Lymphknoten naive CD4 + T-Zell-Reinigung und T_HGM Differenzierung einsetzbar. Die Cytokine Ausdruck von intrazellulären Zytokin Färbung kombiniert mit Durchflusszytometrie zeigte, dass etwa 55 % der Zellen bestimmt waren veranlasst, GM-CSF-exprimierenden Zellen unter der Bedingung T<su…

Materials

RPMI 1640	Biowest	L0500-500
FBS Heat Inactivated	Capricorn	FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
10x PBS	1st Base	BUF-2040-10	Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA	1st Base	BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer	Biolegend	420301	diluted in sterile water
cell strainer	SPL Life Sciences	93070
CD4 microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-Mercaptoethanol	Sigma	M7522
LS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
magnetic stand	Miltenyi Biotec	130-042-303
1ml syringe	Terumo	SS+01T
Centrifuge	Eppendorf	Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter	Sony	Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube	Greiner Bio-One	210261
15m conical centrifuge tube	Greiner Bio-One	188271
FACS tube	Corning	352054
24 well cell culture plate	Greiner Bio-One	662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)	eBioscience	12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC	eBioscience	17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber	Marienfeld	640010
Hyclone Trypan Blue Solution	GE healthcare Life Sciences	SV30084.01
microscope	Nikon	Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody	Biolegend	100314
Purified hamster anti-mouse CD28	BD Biosciences	553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ	eBioscience	16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody	Biolegend	504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein	R&D system	407-ML
Recombinant Mouse IL-6	R&D system	406‑ML
recombinant human TGF-beta	R&D system	240-B-010
PMA	Merck Millipore	19-144
Ionomycin	Sigma	I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor	BD Biosciences	51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set	eBioscience	88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A	Biolegend	506908
APC anti-mouse IFN-gamma	Biolegend	505810
GO Taq qPCR master mix	Promega	A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!	invitrogen	88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA	invitrogen	88-7371-22