Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane
Summary
Mitophagy, den selektiven Abbau von Mitochondrien, hat im mitochondrialen Homöostase in Verbindung gebracht und ist in den verschiedenen menschlichen Krankheiten dereguliert. Bequeme experimentelle Methoden zur Messung Mitophagy Aktivität sind jedoch sehr beschränkt. Hier bieten wir eine sensible Test zur Messung der Mitophagy Tätigkeit mit Durchflusszytometrie.
Abstract
Mitophagy ist ein Prozess der selektiven Entfernung von beschädigten oder unnötige Mitochondrien Autophagie Maschinen. Enge Verbindungen wurden zwischen defekten Mitophagy und verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Stoffwechselerkrankungen gefunden. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese Mitophagy in normalen zellulären Prozessen, wie z. B. Differenzierung und Entwicklung beteiligt ist. Die genaue Rolle der und molekularen Mechanismen, die Mitophagy erfordern jedoch weiteren Studien. Daher ist es wichtig, eine robuste und bequeme Methode zur Messung der Veränderungen im Mitophagy Aktivität zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung der quantitativ Mitophagy Tätigkeit mittels Durchflusszytometrie mit den Mitochondrien gezielt fluoreszierenden Proteins Otamegane (Mt-Otamegane). Dieser Assay Flow Cytometry kann Mitophagy Aktivität schneller und sensibler als bei konventionellen Mikroskopie oder Immunoblotting-basierte Methoden analysieren. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um Mitophagy Aktivität in verschiedenen Zelltypen zu analysieren.
Introduction
Mitochondrien sind Organellen, die Zellproliferation und Physiologie unverzichtbar sind. Mitochondrien sind für die Erzeugung von mehr als 80 % der ATP-Versorgung über Oxidative Phosphorylierung verantwortlich, und sie bieten auch verschiedene Stoffwechsel Zwischenprodukte für Biosynthese und Metabolismus1,2. Neben ihrer Rolle in der Energieversorgung und des Stoffwechsels spielen Mitochondrien zentrale Rollen in viele andere wichtige Prozesse, einschließlich reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Generation, die Regulierung der Zelltod und intrazellulären Ca2 + Dynamik3 . Veränderungen in der Funktion der Mitochondrien wurden mit menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, Diabetes Mellitus und verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten4,5verbunden. Erhöhte mitochondriale Dysfunktion und mitochondriale DNA-Mutationen sind auch gedacht, um zum normalen Alterungsprozess Prozesse6,7,8beitragen. Qualitätskontrolle ist daher ein zentrales Thema in den Mitochondrien. Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die ständig ihre Form zwischen längliche Netzwerke und kurze, fragmentierte Form ändern können. Mitochondrien Dynamik spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Mitochondrien sowie deren Abbau durch Mitophagy9.
Mitophagy ist ein Mechanismus, den selektiven Abbau der ganze Mitochondrien Autophagie Maschinen. Mitophagy ist der Grundsatz Mechanismus zugrunde liegende mitochondriale Umsatz und die Entfernung von beschädigten oder gestörte Mitochondrien. In diesem Prozess sind Mitochondrien vor umgeben durch eine Membran, was zur Bildung von autophagosom, die dann mit Lysosomen für hydrolytische Abbau9verschmelzen. Vorherigen genetischen Drosophila deutet an, dass zwei der Parkinson-Krankheit-Genen, PTEN-induzierte vermeintliche Kinase 1 (PINK1) (PARK6) und Parkin (PARK2), funktionieren in der gleichen Weg10,11. Untersequenz Studien haben gezeigt, dass der PINK1-Parkin Weg verantwortlich ist für die Beseitigung der beschädigten Mitochondrien und Mängel in diesem Weg führen dysfunktionalen Mitophagy und dazu, Krankheiten beim Menschen12,13 beitragen kann. Defekte in Mitophagy Prozesse wurden vor kurzem in verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauferkrankungen, Erkrankungen der Leber und Neurodegenerative Krankheit 14gefunden. Neuere Studien haben darüber hinaus auch gezeigt, dass Mitophagy entscheidend für viele physiologische Prozesse, z. B. Differenzierung und Entwicklung der Immunantwort15,16,17,18 ,19, was darauf hindeutet, dass Mitophagy eine aktivere Rolle bei der Kontrolle der Zellfunktionen spielen kann.
Trotz den letzten Bestätigung des Mitophagy spielt eine wichtige Rolle in beiden Qualitätskontrolle in den Mitochondrien und menschlicher Erkrankungen, die molekularen Mechanismen, die Mitophagy bleiben schlecht verstanden. Obwohl Mitophagy-bezogene Mechanismen in der Hefe systematisch untersucht worden sind, haben Studien zur Erforschung Mitophagy-bezogene Mechanismen in Säugetierzellen hauptsächlich auf den PINK1-Parkin Weg konzentriert. Frühere Studien haben festgestellt, dass die PINK1-Parkin-Weg in erster Linie verantwortlich für die selektive Entfernung von beschädigten Mitochondrien über Mitophagy12,20,21. Jedoch haben neuere Studien berichtet, dass bei einigen Modellen auch in Abwesenheit von funktionalen PINK122,23,24Mitophagy aktiviert werden kann. Diese Ergebnisse legen nahe, dass neben den PINK1-Parkin Weg, dort eine zusätzliche unbekannten Weg, die Mitophagy aktivieren können.
Das Fehlen eine bequeme Methode, um Mitophagy Tätigkeit zu beurteilen ist ein Haupthindernis zu erkunden die Wege, die Mitophagy und ihre Rolle bei der pathophysiologischen Ereignisse zu regulieren. Elektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Autophagosome verschlungen Mitochondrien direkt sichtbar zu machen. Elektronen-Mikroskopie hat jedoch Einschränkungen bei der Quantifizierung der Mitophagy Aktivität. Obwohl die Strategien, mit denen Mikrotubuli-assoziierten Protein-1 Kette 3 (LC3) Licht-konjugierte fluoreszierende Sonden, wie GFP-LC3, sind derzeit die am weitesten verbreitete Ansätze25, die vergängliche Natur des Signals LC3-basierte und seine hohe falsch-Positive Signale begrenzen seine Empfindlichkeit zur Erkennung von Mitophagy in Zellen26. Eine Kombination von westlichen Beflecken zur Messung der mitochondrialen Protein-Ebene, die Quantifizierung der mitochondrialen DNA und Fluoreszenz-Mikroskopie-Analyse zu Mitochondrien mit autophagosom oder Lysosomen colocalize wäre ein guter Ansatz für die Bewertung Mitophagy. Allerdings rufen Quantifizierung Einschränkungen und mangelnder Komfort von bestehenden Methoden für neue Ansätze. Die Einführung einer neuen pH-abhängig fluoreszierenden Proteins, das mitochondriale Ziel Otamegane (Mt-Otamegane), verbessert stark die Fähigkeit, Mitophagy27zu erkennen. Durch die Verschmelzung der mitochondrialen Zielversionen Abfolge von Cytochrom C Oxidase Untereinheit VIII (COX VIII) in Otamegane, richtet sich die Mt-Otamegane an der mitochondrialen Matrix. Die große Verschiebung in der Erregung Höhepunkt des Tages von 440 nm auf 586 nm (entsprechend pH 7 und pH 4, beziehungsweise) kann genutzt werden, um Mitophagy mit guten sensibel in in Vitro und in Vivo Experimente28,29 bewerten . Noch wichtiger ist, verursacht der Widerstand der Mt-Otamegane lysosomalen Abbau die Integration des Mt-Otamegane Signals in Lysosomen, ermöglicht die einfache quantitative Messung der Mitophagy Tätigkeit. Die Fluoreszenz-Änderung, die in Mt-Otamegane Auftritt kann entweder konfokalen Mikroskopie analysiert werden oder flow Cytometry28,29. Jedoch hat eine Flow Cytometry basierende Methode zur Messung der Mitophagy Tätigkeit mit Mt-Tages im Detail bis heute nicht erbracht.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine Flow Cytometry basierende Technik zur Messung Mitophagy Aktivität in den Zellen mit Mt-Otamegane. Obwohl wir hier gezeigt haben, dass Flow Cytometry Analyse erfolgreich CCCP-induzierten Mitophagy in HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Parkin erkannt, kann diese Technik auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und empfindliche Methode für die Verwendung von Durchflusszytometrie, zelluläre Mitophagy Aktivität in den Zellen, die mit dem Ausdruck Mt-Otamegane zu messen. Durchläuft ein hohes Maß an Mitophagy Zellen weisen ein erhöhtes Verhältnis von PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) Erregung. So kann Mitophagy Aktivität als der Anteil der Zellen ausstellenden ein hohes Verhältnis von 561/405 ausgedrückt werden. Wir berechnen den Prozentsatz der Zellen in der Region “hohe” Tor a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (, J. U.) und der National Research Foundation von Korea (NRF) Zuschuss gefördert durch den Korea-government(MSIT) (Nr. 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (, J.Y unterstützt. .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
Referências
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