Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima
Summary
Mitophagy, la degradazione selettiva dei mitocondri, è stato implicato nell’omeostasi mitocondriale ed è liberalizzato in varie malattie umane. Tuttavia, convenienti metodi sperimentali per misurare l’attività di mitophagy sono molto limitati. Qui, forniamo un test sensibile per misurare l’attività di mitophagy mediante citometria a flusso.
Abstract
Mitophagy è un processo di rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati o non necessari utilizzando macchinari di autofagia. Stretti legami sono state trovate fra mitophagy difettoso e varie malattie umane, tra cui le malattie neurodegenerative, cancro e malattie metaboliche. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che mitophagy è coinvolto nei processi cellulari normali, quali la differenziazione e lo sviluppo. Tuttavia, il ruolo preciso di e meccanismi molecolari alla base di mitophagy richiedono ulteriore studio. Pertanto, è fondamentale per sviluppare un metodo robusto e conveniente per misurare i cambiamenti nell’attività di mitophagy. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per valutare quantitativamente mitophagy attività tramite citofluorimetria usando la proteina fluorescente mitocondrio-mirati Keima (mt-Keima). Questa analisi di citometria a flusso è in grado di analizzare più rapidamente e con sensibilità rispetto ai metodi convenzionali di microscopia o immunoblotting basato mitophagy attività. Questo protocollo può essere applicato per analizzare l’attività di mitophagy in vari tipi cellulari.
Introduction
I mitocondri sono organelli che sono essenziali per la fisiologia e la proliferazione delle cellule. I mitocondri sono responsabili della generazione più dell’80% del rifornimento di ATP tramite fosforilazione ossidativa, e forniscono anche vari intermedi metabolici per biosintesi e metabolismo1,2. Oltre ai loro ruoli nella fornitura di energia e metabolismo, i mitocondri giocano un ruolo centrale in molti altri processi importanti, tra cui la generazione di specie (ROS) reattive dell’ossigeno, nella regolazione della morte cellulare e intracellulare Ca2 + dynamics3 . Le alterazioni nella funzione mitocondriale sono state associate con malattie umane, compreso il cancro, diabete mellito e vari neurodegenerative malattie4,5. Aumentata la disfunzione mitocondriale e mutazioni del DNA mitocondriale sono anche pensate di contribuire ai processi di invecchiamento normale6,7,8. Di conseguenza, il controllo di qualità è una questione cruciale in mitocondri. I mitocondri sono organelli altamente dinamici che possono continuamente cambiare la loro forma tra reti allungate e forma breve, frammentato. Dinamiche di mitocondri svolge un ruolo importante nel mantenimento della funzione dei mitocondri, come pure la loro degradazione attraverso mitophagy9.
Mitophagy è un meccanismo che coinvolge la degradazione selettiva dei mitocondri interi utilizzando le macchine di autofagia. Mitophagy è il meccanismo di principio sottostante fatturato mitocondriale e la rimozione dei mitocondri danneggiati o disfunzionale. In questo processo, i mitocondri sono in primo luogo circondati da una membrana, causando la formazione di autofagosomi, che poi si fondono con i lisosomi per degradazione idrolitica9. Precedenti studi genetici in Drosophila hanno suggerito che due geni legati al morbo di Parkinson, indotta da PTEN putativa chinasi 1 (PINK1) (PARK6) e parkina (PARK2), funzionare nella stessa via10,11. Sottosequenza studi hanno dimostrato che la via di PINK1-Parkin è responsabile per l’eliminazione dei mitocondri danneggiati e difetti in questo risultato di percorso in mitophagy disfunzionali e può contribuire a malattie umane12,13. Difetti nei processi di mitophagy recentemente sono stati trovati in varie malattie umane, compreso il cancro, malattie cardiache, malattie del fegato e neurodegenerative malattia 14. Inoltre, recenti studi hanno inoltre dimostrato che mitophagy è fondamentale per molti processi fisiologici, quali la risposta immunitaria15,16,17,18, sviluppo e differenziazione ,19, suggerendo che mitophagy può svolgere un ruolo più attivo nel controllare le funzioni delle cellule.
Nonostante la recente conferma che mitophagy svolge un ruolo importante nel controllo di qualità sia nei mitocondri e malattia umana, i meccanismi molecolari sottostanti mitophagy rimangono mal capito. Anche se meccanismi mitophagy-relativi sono stati studiati sistematicamente in lievito, studi volti a esplorare meccanismi correlati mitophagy in cellule di mammifero sono concentrati principalmente sulla via di PINK1-Parkin. Precedenti studi hanno stabilito che la via di PINK1-Parkin è principalmente responsabile per la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati via mitophagy12,20,21. Tuttavia, studi recenti hanno riferito che in alcuni modelli, può essere attivato anche in assenza del funzionale PINK122,23,24mitophagy. Questi risultati indicano che oltre la via di PINK1-Parkin, lì un percorso aggiuntivo non identificato che può attivare mitophagy.
L’assenza di un metodo pratico per valutare l’attività mitophagy è un ostacolo importante a esplorare le vie che regolano mitophagy e il suo ruolo in eventi patofisiologici. La microscopia elettronica è uno strumento potente per visualizzare direttamente i mitocondri autofagosoma-inghiottito. Tuttavia, la microscopia elettronica ha limitazioni nella quantificazione mitophagy attività. Anche se le strategie che utilizzano microtubule-associated protein-1 luce catena 3 (LC3)-coniugati sonde fluorescenti, come GFP-LC3, sono attualmente i più diffusi approcci25, la natura transitoria del segnale basato su LC3 e suo alto tasso di falsi positivi segnali limitano la sua sensibilità per la rilevazione mitophagy in cellule26. Una combinazione di western blotting per misurare il livello di proteina mitocondriale, la quantificazione di DNA mitocondriale e analisi di microscopia di fluorescenza per colocalize mitocondri con autofagosomi o lisosomi sarebbe un buon approccio per la valutazione mitophagy. Tuttavia, limiti di quantificazione e una mancanza di convenienza delle metodologie esistenti richiedono nuovi approcci. L’introduzione di una nuova proteina fluorescente pH-dipendente, l’obiettivo mitocondriale Keima (mt-Keima), ha notevolmente migliorato la capacità di rilevare mitophagy27. Fondendo la sequenza mitocondriale-targeting di citocromo c ossidasi secondaria VIII (COX VIII) in Keima, mt-Keima è diretto alla matrice mitocondriale. Il grande cambiamento nel picco di eccitazione di Keima da 440 nm a 586 nm (corrispondente a pH 7 e pH 4, rispettivamente) possono essere utilizzati per valutare mitophagy con buona sensibile in sia in vitro che in vivo esperimenti28,29 . Ancora più importante, la resistenza di mt-Keima a degradazione lisosomiale causa l’integrazione del segnale del mt-Keima nei lisosomi, consentendo la facile misurazione quantitativa dell’attività mitophagy. La variazione di fluorescenza che si verifica in mt-Keima flusso cytometry28,29o possa essere analizzata usando sia la microscopia confocal. Tuttavia, un metodo basato su citometria a flusso per misurare l’attività di mitophagy utilizzando mt-Keima non è stato fornito in dettaglio fino ad oggi.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per una tecnica di base di cytometry di flusso per misurare l’attività di mitophagy in cellule utilizzando mt-Keima. Anche se vi abbiamo mostrato qui che l’analisi di citometria a flusso rilevato con successo mitophagy CCCP-indotta in cellule HeLa esprimendo Parkin, questa tecnica può essere applicata a una vasta gamma di tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un metodo veloce e sensibile per mediante citometria a flusso per misurare l’attività cellulare mitophagy in cellule che esprimono mt-Keima. Le cellule che subiscono un elevato livello di mitophagy presentano un rapporto aumentato di PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) eccitazione. Quindi, mitophagy attività può essere espresso come la percentuale di cellule che esibiscono un alto rapporto di 561/405. Abbiamo calcolato la percentuale delle cellule della regione “alto” cancello su un terreno di puntino …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (di J. U.) e dalla National Research foundation di Corea (NRF) sovvenzione finanziati dalla government(MSIT) di Corea (n. 2016R1A2B2008887, n. 2016R1A5A2007009) (a J.Y. .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
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