Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para a caracterização bioquímica de enzimas de RNA-modificando o fermento, Mod5 e discutir como este protocolo poderia ser aplicado a outras enzimas RNA-modificando.

Resumo

N⁶- isopentenyladenosine do RNA modificações é funcionalmente diversificada e altamente conservadas entre procariontes e eucariontes. Dentre as modificações de isopentenyladenosine -⁶N mais altamente conservadas ocorre na posição A37 em um subconjunto dos tRNAs. Esta modificação melhora a eficiência de conversão e fidelidade, aumentando a afinidade do tRNA para o ribossoma. Mutação das enzimas responsáveis por essa modificação em eucariontes estão associados a vários Estados de doenças, incluindo câncer e disfunção mitocondrial. Portanto, compreender a especificidade de substrato e actividades bioquímicas destas enzimas é importante para a compreensão da biologia eucariótica normal e patológica. Um diversificado leque de métodos tem sido empregado para caracterizar eu⁶A modificações. Aqui é descrita uma abordagem direta para a detecção de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza a incubação de RNAs com uma transferase de isopentenilo recombinantes, seguido por digestão de RNase T1 e análise de eletroforese de gel 1-dimensional eu detectar⁶A modificações. Além disso, a potencial capacidade de adaptação do presente protocolo para caracterizar outras enzimas RNA-modificando é discutida.

Introdução

Foram identificadas pelo menos 163 modificações de RNA posttranscriptional distintas, com estas modificações conferem funções diversas e contexto-dependente de RNAs, directamente influenciam a estrutura do RNA e afetando interações de RNA com outros moléculas^1,2. À medida que aumenta a apreciação para o número e variedade de modificações do RNA, é fundamental desenvolver ensaios que podem confiantemente interrogar tanto as modificações de RNA e as enzimas que catalisam a eles.

Dentre as modificações de RNA primeiras a identificação ocorre em 37 base em tRNAs, adjacente a anticódon n....

Protocolo

Nota: O protocolo foi adaptado de ref. ²⁴.

1. obter o RNA e a enzima de interesse

1. Uso em vitro transcrito RNAs internamente rotulados com ³²P, e His6-Mod5 recombinante expressa em e purificado de e. coli, como descrito anteriormente,²⁴.
   1. Introduzir em vitro transcrito RNAs (seção 3) usando T7 RNA polimerase na presença de ATP sem rótulo, UTP, CTP, GTP e 10 µCi de gel-purificado, etanol-precipitado α-ATP, resuspended em 1 x TE (pH 7,5, 0,1 mM EDTA de 10 mM Tris-HCl) e armazenado a-80 ° C ²⁴.
2. Co....

Resultados

Mod5 foi incubado com uma tirosina tRNA ou serina tRNA na presença ou ausência de DMAPP. Após a reação de modificação, produtos foram RNase T1-digerido, que fende a extremidade 3' de todos os guanosines deixando um 3' guanosina (GMP) de monophosphates²⁴ (Figura 1). Digestão completa dos RNAs produz um padrão previsível de radiolabeled fragmentos(Figura 2),que então são resolvidos em uma 20.......

Discussão

Modificações de RNA continuam a ser mostrado para desempenhar um papel cada vez mais importante e diverso no celular e a função. Como tal, o desenvolvimento de ensaios para interrogar o RNA enzimas de modificação é fundamental para compreender melhor os aspectos fundamentais da biologia. Este protocolo descreve um ensaio de alta resolução em vitro para caracterizar a atividade de modificação do tRNA do Mod5.

Este protocolo tem a vantagem de fornecer uma leitura direta e facilmente int.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
UreaGel Concentrate	National Diagnostics	EC-833	Como parte de um kit
UreaGel Diluent	National Diagnostics	EC-833	Como parte de um kit
UreaGel Buffer	National Diagnostics	EC-833	Como parte de um kit
10x TBE	National Diagnostics	EC-833	Como parte de um kit
Persulfato de amônio (APS)	Sigma-Aldrich	7727-54-0
N, N, N′, N′ -Tetrametiletilenodiamina (TMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Ácido bórico	Sigma-Aldrich	10043-35-3
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
	DMAPP Caymen Chemical	1186-30-7
Super RNaseIN	ThermoFisher Scientific	AM2694
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
Etanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	127-09-3
Rnase T1	ThermoFisher	Scientific EN0541
Glicerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
Xileno cianol	Sigma-Aldrich	2650-17-1
Equipamentos e Suprimentos
Placas de vidro curtas (20-40 cm L x 40 cm L)	The Gel Company
Placas de vidro longas (20-40 cm L x 40 cm C)	The Gel Company
Aparelho de gel vertical	The Gel Company	S2-3040
Seringa descartável de 50 mL	Fisher Scientific	03-377-26
Clipes de pasta de aço inoxidável	Idea Scientific	1066
Phosphoscreen	Sigma-Aldrich	28-9564-74
Filme plástico	(mercearia local)