Zika वायरस (ZIKV) संक्रमण के लिए Ifnar1-/- murine मॉडल के immunoprivileged अंगों में antigen-विशिष्ट T-कक्ष प्रत्युत्तरों का मूल्यांकन करने के लिए कोई प्रोटोकॉल वर्णन किया गया है । इस विधि सुरक्षा और ZIKV टीकों के immunopathogenesis के सेलुलर तंत्र की जांच के लिए निर्णायक है और उनके प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए भी मूल्यवान है ।
Zika वायरस (ZIKV) immunoprivileged अंगों में सूजन पैदा कर सकते हैं (जैसे, मस्तिष्क और वृषण), Guillain-Barré सिंड्रोम के लिए अग्रणी है और परीक्षण को नुकसान पहुँचाए. ZIKV के साथ एक संक्रमण के दौरान, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऊतकों में घुसपैठ करने के लिए दिखाया गया है । हालांकि, सेलुलर तंत्र है कि सुरक्षा और/या एक ZIKV संक्रमण के दौरान इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के immunopathogenesis परिभाषित अभी भी मोटे तौर पर अज्ञात हैं । साथ ही, हम ZIKV-संक्रमित चूहों के इन immunoprivileged अंगों में वायरस-विशिष्ट टी-सेल कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं. इन पद्धतियों में शामिल हैं) एक ZIKV संक्रमण और वैक्सीन टीका में Ifnar1-/ ख) histopathology, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और immunohistochemistry परख वायरस के संक्रमण और मस्तिष्क में सूजन का पता लगाने के लिए, testes, और तिल्ली; c) ZIKV-व्युत्पन्न टी-सेल epitopes के एक tetramer की तैयारी; घ) मस्तिष्क से पृथक monocytes में ZIKV-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने, परीक्षण, और तिल्ली. इन तरीकों का उपयोग करना, यह संभव है antigen-विशिष्ट टी कोशिकाओं है कि immunoprivileged अंगों में घुसपैठ की है और संक्रमण के दौरान इन टी कोशिकाओं के कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए का पता लगाने के लिए: वायरस की मंजूरी के माध्यम से संभावित प्रतिरक्षा संरक्षण और /या immunopathogenesis सूजन को गहरा करने के लिए । इन निष्कर्षों को भी ZIKV के खिलाफ प्रतिरक्षण द्वारा प्रेरित टी कोशिकाओं के योगदान को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं ।
ZIKV एक मच्छर जनित flavivirus है कि पहले १९४७ में युगांडा में एक ज्वर रीसस समूल से पृथक किया गया है । हाल ही में, ZIKV एक सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकाल बन गया है, अमेरिका में अपनी तेजी से प्रसार और microcephaly और Guillain के लिए अपनी अप्रत्याशित कड़ी के कारण-Barré सिंड्रोम1,2,3। महामारी विज्ञान के आंकड़ों से, ZIKV लगभग ४,००० संक्रमित वयस्कों4प्रति में Guillain-Barré सिंड्रोम का कारण होना संदिग्ध हो गया है । इसके अलावा, ZIKV के बीच एक संबंध है और परीक्षण के संक्रमण/माउस मॉडल में नुकसान का प्रदर्शन किया गया है, सुझाव है कि ZIKV संक्रमण, कुछ परिस्थितियों में, रक्त वृषण बाधा बाईपास और अंततः पुरुष बांझपन 5 के लिए नेतृत्व कर सकते है . इन निष्कर्षों को पूरी तरह से एक ZIKV संक्रमण के दौरान सुरक्षात्मक या रोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की प्रेरण को समझने के महत्व पर प्रकाश डाला ।
बहुत ZIKV को सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बारे में सीखा जा रहा है । CD4+ और सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं को कैप्सिड, लिफाफे, और गैर संरचनात्मक प्रोटीन 1 (NS1) में मनाया गया है ZIKV-संक्रमित बंदरों और मनुष्यों6,7,8। चूहों में, कई अध्ययनों से संकेत दिया है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं ZIKV प्रतिकृति9,10,11को नियंत्रित करने में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाते हैं । महत्वपूर्ण बात, Jurado एट अल. प्रदर्शन किया है कि रक्त मस्तिष्क बाधा के टूटने में एक ZIKV संक्रमण के परिणाम और Ifnar1 के परीक्षण के भीतर सीडी 8+ प्रभाव टी कोशिकाओं के perivascular घुसपैठ-/ इसके अलावा, वे सीडी 8+ टी कोशिकाओं ZIKV-जुड़े पक्षाघात भड़काने और नवजात मस्तिष्क immunopathology में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाई देते हैं कि पता चला. पिछले एक अध्ययन में, हम ZIKV-E294-302 tetramer तैयार किया और पता चला कि ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं के दिमाग और रीढ़ की हड्डी में मौजूद ZIKV-संक्रमित Ifnar1-/- चूहों, जो डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकता है और ZIKV टीके का विकास10.
ZIKV संक्रमण को रोकने के लिए टीकाकरण के लिए तत्काल जरूरत के जवाब में, कई टीके आरएनए टीके, रिकॉमबिनेंट वेक्टर आधारित टीके, और शुद्ध प्रोटीन उपइकाई टीके सहित विकास के लिए नैदानिक चरणों में हैं । प्लाज्मिड डीएनए वैक्सीन चरण 1 नैदानिक परीक्षण12में है । ZIKV टीकों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन, इसलिए महत्वपूर्ण है । टीके का एक लाभ उनके लिए विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं, जो ZIKV के खिलाफ संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है बटोरने की क्षमता है । ZIKV-व्युत्पन्न टी सेल epitope से संबंधित tetramers का उपयोग करके, एक एडीनोवायरस-वेक्टर आधारित ZIKV वैक्सीन द्वारा प्रेरित टी सेल immunoreactivity प्रतिरक्षित चूहों में पता लगाया जा सकता है, और दोनों एम और ई नच मजबूत प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 प्रेरित करने के लिए दिखाए गए थे+ टी सेल immunoreactivity13.
एक वायरस के संक्रमण के दौरान, प्रमुख histocompatibility (MHC) अणुओं द्वारा प्रस्तुत पेप्टाइड एंटीजन की पहचान टी सेल रिसेप्टर (TCR) के लिए एक महत्वपूर्ण टी सेल की मध्यस्थता के लिए मेजबान14की रक्षा प्रणाली है. इस सिद्धांत के आधार पर, tetramer प्रौद्योगिकी एक अनूठा उपकरण को स्पष्ट भूमिकाओं कि प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में खेलने के लिए है15। यह प्रोटोकॉल ZIKV संक्रमण के लिए Ifnar1-/- माउस मॉडल की स्थापना का वर्णन करता है, और तिल्ली, मस्तिष्क, और tetramer प्रौद्योगिकी का उपयोग करके चूहों के परीक्षण में प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं का पता लगाने । इसके अतिरिक्त, हम AdC7 चूहों में एक ZIKV वैक्सीन (प्रतिरक्षित-एम/ई) द्वारा प्रेरित टी सेल immunoreactivity का पता लगाने और मूल्यांकन करने के लिए ZIKV-E294-302 tetramer का इस्तेमाल किया । यह अध्ययन immunoprivileged अंगों में टी सेल प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए मार्गदर्शन प्रदान करता है और अपरा या भ्रूण मस्तिष्क में संभावित अनुप्रयोगों के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है ।
Immunogenic टी सेल epitope सेलुलर प्रतिरक्षा के खिलाफ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है23रोगजनकों । इस प्रकार, immunoprivileged अंगों में ZIKV-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने के प्राकृतिक ZIKV संक्रमण के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति है । इस बीच, टी सेल रिस्पांस डिटेक्शन वायरल वैक्सीन की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है । यहां, हम प्रयोगों, जो तिल्ली, मस्तिष्क से लिम्फोसाइटों के अलगाव शामिल कल्पना करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल दिखाने के लिए, और ZIKV-संक्रमित चूहों के परीक्षण, immunodominant epitope ई294-302 tetramer की तैयारी, और ZIKV-संक्रमित चूहों के immunoprivileged अंगों में ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं की मान्यता.
एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि एक जीवित ZIKV या उसकी आरएनए पुरुष रोगियों के वीर्य में पता लगाया जा सकता है, जो इंगित करता है कि ZIKV रक्त वृषण बाधा बाईपास और प्रजनन प्रणाली में खुद को दोहराने कर सकते हैं24. पहले, हम यह भी पता चला है कि ZIKV परीक्षण नुकसान का कारण बन सकता है और चूहों25में पुरुष बांझपन के लिए सीसा । ZIKV संक्रमण रीसस बंदरों में viremia का कारण बन सकता है, और वायरल आरएनए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में पाया जा सकता है, साथ ही आंत अंगों में । Immunohistochemistry से पता चला कि ZIKV-विशिष्ट एंटीजन सीएनएस में प्रस्तुत किए गए और मल्टीपल पेरिफेरल अंगों को26. इसके अलावा, murine मॉडल में, ZIKV संक्रमण प्लीहा और26सीएनएस में एक मजबूत एंटीवायरल सीडी 8+ टी सेल प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है ।
पिछले काम की तुलना में, इस अध्ययन के लिए व्यवस्थित तरीके स्थापित ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं मस्तिष्क और testes, जो immunoprivileged साइटों रहे है में पता लगाने के लिए । ZIKV-संक्रमित चूहों के immunoprivileged अंगों में विषाणु-विशिष्ट टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता का आकलन करना जरूरी है. immunoprivileged अंगों में ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए tetramers का उपयोग बहुत ZIKV संक्रमण और उनके मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बारे में हमारी समझ में वृद्धि होगी । ई294-302 tetramer का उपयोग करना, मस्तिष्क और वृषण में वायरस विशिष्ट टी कोशिकाओं को प्रवाह cytometry द्वारा अलग किया जा सकता है, एक ZIKV संक्रमण के दौरान सुरक्षा और immunopathogenesis के सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए । इस बीच, यह ZIKV को नियंत्रित करने के लिए सीडी 8+ टी कोशिकाओं के कार्यों को आगे की जांच करने के लिए, या ZIKV संक्रमण के दौरान इन अंगों में immunopathogenesis को बढ़ाने के लिए शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है ।
immunoprivileged अंगों में antigen-विशिष्ट murine सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए, हम एच 2dबी-ई294-302 tetramer तैयार है और सीडी 8+ टी कोशिकाओं का पता लगाया द्वारा प्रवाह cytometry । Tetramers antigen-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं । यहाँ तीन प्रकार के fluorochrome-संयुग्मित streptavidin (सुरक्ष, PE, and BV421) उत्पन्न हुए । यद्यपि APC-, BV421-, और pe-लेबल tetramers antigen-विशिष्ट T कक्षों का पता लगाने के लिए में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर हैं, pe-लेबल pMHC-I tetramers श्रेष्ठ परिणाम प्राप्त । अत: इस अध्ययन में पीई-लेबल tetramer का प्रयोग किया गया । मजे की बात है, पीई लेबल एच 2dबी-ई294-302 tetramer पर आधारित है, हम दोनों मस्तिष्क और परीक्षण में प्रतिजन विशिष्ट टी कोशिकाओं के उच्च अनुपात का पता चला, जो वायरस के रक्त से विशिष्ट टी कोशिकाओं की माइग्रेशन क्षमता का संकेत immunoprivileged अंगों ।
हालांकि, प्रोटोकॉल के लिए कुछ सीमाएं हैं । एच 2dबी-ई294-302 tetramer मानव टी सेल का पता लगाने के लिए उपयोगी नहीं है, क्योंकि tetramer का पता लगाने MHC प्रतिबंध पर निर्भर है । immunodominant एचएलए-प्रतिबंधित पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग की अब भी जरूरत है । इसके अलावा, रेट्रो कक्षीय संक्रमण एक ZIKV संक्रमण के लिए प्रभावी है, लेकिन कुछ जांचकर्ताओं के लिए एक सुविधाजनक आपरेशन नहीं हो सकता है । इस प्रकार, संक्रमण के अंय मार्गों, पेरिटोनियल, चमड़े के नीचे, या नसों सहित, भी सिफारिश कर रहे हैं ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, एक महत्वपूर्ण कदम मस्तिष्क और वृषण से monocytes का अलगाव है । यह उच्च गुणवत्ता लिम्फोसाइटों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है; इस प्रकार, यह ध्यान देना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, केंद्रापसारक गति, पीस ऊतक की ताकत है, और मस्तिष्क और वृषण ऊतक के विच्छेदन । इसके अलावा, tetramer तैयारी के लिए, छेड़ने वाला अवरोधकों (PMSF, pepstatin, leupeptin) जब एक प्रोटीन को नीचा होने से बचाने में सहायक होते हैं । इसलिए, यह समझ में आता है करने के लिए एक छेड़ने अवरोधक जोड़ने के लिए बफर और tetramer तैयारी की प्रक्रिया के दौरान बफर विनिमय ।
अंत में, हम एक ZIKV संक्रमण के लिए Ifnar1-/- माउस मॉडल के immunoprivileged अंगों में प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के तरीके प्रस्तुत करते हैं । इस मंच व्यापक रूप से उभरते और फिर से उभरते वायरस है जो रक्त और immunoprivileged अंगों के बीच बाधाओं बाईपास कर सकते है की प्रतिरक्षा तंत्र की जांच लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस अध्ययन के उंमीदवार टीके और immunotherapies के भविष्य के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त हो सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक अंग्रेजी संशोधन के लिए गैरी वोंग का शुक्र है । यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (ग्रांट 2017YFC1200202), चीन के संक्रामक रोग अनुसंधान (ग्रांट 2016ZX10004222-003) के लिए प्रमुख विशेष परियोजनाओं द्वारा समर्थित किया गया. जॉर्ज एफ गाओ चीन अभिनव अनुसंधान समूह (अनुदान ८१६२१०९१) के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के एक प्रमुख अंवेषक है ।
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |