Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Organisation der astrocytic Netzwerke zu beurteilen. Das beschriebene Verfahren minimiert Vorspannung um beschreibende Maßnahmen dieser Netze z. B. Zellzahl, Größe, Umgebung und Position innerhalb eines Kerns zu bieten. Anisotropie ist mit einer vektoriellen Analyse bewertet.
Abstract
Es ist immer deutlicher geworden, dass Astrozyten neuronale Funktion nicht nur auf der synaptischen und einzellige Ebene, sondern auch auf der Netzwerkebene modulieren. Astrozyten sind stark miteinander verbunden durch Gap Junctions und Kupplung durch diese Kreuzungen ist dynamisch und stark reguliert. Eine aufstrebende Konzept ist, dass astrocytic Funktionen spezialisiert und an die Funktionen der neuronalen Schaltung angepasst, mit dem sie verbunden sind. Daher sind Methoden zur Messung verschiedener Parameter der astrocytic Netze, die Regeln für ihre Kommunikation und Kupplung besser zu beschreiben und um ihre Funktionen zu verstehen benötigt.
Hier, unter Verwendung der Bildanalyse-Software (zB., ImageJFIJI), wir beschreiben eine Methode zur Analyse konfokale Bilder astrocytic Netzwerke von Farbstoff-Kupplung offenbart. Diese Methoden ermöglichen (1) eine automatisierte und unvoreingenommene Erkennung von markierten Zellen (2) Berechnung der Größe des Netzes, (3) Berechnung der bevorzugte Ausrichtung der Farbstoff innerhalb des Netzwerks zu verbreiten, und (4) Neupositionierung des Netzes innerhalb des Bereichs des Interesses .
Diese Analyse kann zur astrocytic Netzwerke eines bestimmten Gebietes zu charakterisieren, Netzwerke verschiedener Bereiche, die verschiedene Funktionen zugeordnet, oder vergleichen Netzwerke unter verschiedenen Bedingungen, die unterschiedliche Auswirkungen auf Kupplung haben gewonnen. Diese Beobachtungen führen zu wichtigen funktionalen Überlegungen. Zum Beispiel analysieren wir die astrocytic Netzwerken aus einem trigeminus Kern, wo wir zuvor gezeigt haben, daß astrocytic Kupplung entscheidend für die Fähigkeit von Nervenzellen, ihre impulsmuster von Tonika auf rhythmische platzen1wechseln. Durch die Messung der Größe, Entbindung und bevorzugte Ausrichtung der astrocytic Netzwerke in diesem Kern, können wir Hypothesen über funktionelle Domänen erstellen, die sie umschreiben. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass mehrere andere Hirnareale, einschließlich Barrel Cortex, seitliche überlegene Olive, olfaktorische Glomeruli und sensorischen Kerne in den Thalamus und visuellen Kortex, um nur einige zu nennen eine ähnliche Analyse profitieren können.
Introduction
Viele Studien haben beschrieben, wie der Neuron-Astrozyten Dialog eine Ebene der subzellulären oder synaptic in neuronalen Funktionen und synaptische Übertragung auswirken kann. Es ist allgemein bekannt, dass die Astrozyten empfindlich zu den umliegenden neuronalen Aktivität; in der Tat haben sie Rezeptoren für viele Neurotransmitter wie Glutamat, GABA, Acetylcholin und ATP (siehe zuvor veröffentlichten Bewertungen2,3,4). Im Gegenzug verarbeitet astrocytic Ensheath synaptischen Elemente und Einfluss neuronaler Aktivität dort und an extrasynaptic Standorten durch Regulierung der extrazellulären Ionischen Homöostase und Freigabe mehrere Faktoren oder Transmitter wie Glutamat, D-Serin und ATP 5 , 6 , 7.
Die Idee, dass Astrozyten auch neuronale Funktion auf der Netzwerkebene modulieren können hat, Beweise gezeigt, dass astrocytic Kupplung räumlich geregelt ist und neuronalen Segmentierung in Bereichen zeichnet sich durch eine klare anatomische entspricht Abschottung (wie Bereiche mit sensorischen Darstellungen), darauf hinweist, dass Astrozyten koppeln werden an andere Astrozyten dienen die gleiche Funktion anstatt nur diejenigen, die ganz in der Nähe sind. In der seitlichen überlegene Olive orientieren sich zum Beispiel am meisten astrocytic Netzwerke orthogonal zu der tonotopen Achse8, während in den Lauf Kortex oder Olfactoty Glomeruli, Kommunikation zwischen Astrozyten in Fässern oder Glomeruli viel stärker ist und schwächeren zwischen benachbarten,9,10. In beiden Fällen orientieren sich die astrocytic Netzwerke an das Zentrum der Nierenbeckenentzündung oder Lauf9,10.
Wir zeigten kürzlich, dass astrocytic Aktivität neuronale feuern moduliert durch eine Verringerung der Konzentration der extrazellulären Ca2 + ([Ca2 +]e), vermutlich durch die Freisetzung von S100β, Ca2 +-bindende Protein11. Dieser Effekt, der in einer Population von trigeminus Rhythmogenic Neuronen im dorsalen Teil des Trigeminus sensorischen Main Kern (NVsnpr zeigte, gedacht, um eine wichtige Rolle bei der Erzeugung von physiologischen Bewegungen), ergibt sich daraus, dass rhythmische feuern in diesen Neuronen hängt eine persistente Na+ aktuelle, die durch die Verluste von [Ca2 +]e11,12gefördert wird. Rhythmische feuern in diese Neuronen kann “physiologisch” durch Stimulation der Eingaben oder künstliche Verringerung der [Ca2 +]eausgelöst. Weiter zeigten wir, dass astrocytic Kupplung für neuronale rhythmische feuern1erforderlich war. Dies erhöht die Möglichkeit, dass astrocytic Netzwerke umschriebene Funktionsbereiche bilden können, wo neuronaler Aktivität synchronisiert und koordiniert werden können. Um diese Hypothese zu beurteilen, mussten wir zuerst eine Methode um die Organisation dieser Netze innerhalb NVsnpr rigoros zu dokumentieren zu entwickeln.
Frühere Studien zu astrocytic Netzwerke haben vor allem das Ausmaß der Kupplung in Bezug auf die Anzahl von Zellen und die Dichte und die Fläche beschrieben. Versuche, die Form der astrocytic Netzwerke und die Richtung der Farbstoff-Kupplung zu bewerten waren meist durch einen Vergleich der Größe der Netze auf zwei Achsen (X und y) im Fass Kortex9, Hippocampus13,14, durchgeführt 15, Barreloid Felder der Thalamus16, seitliche überlegene Olive8, olfaktorische Glomeruli10und Kortex14. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen unvoreingenommene Grafen von markierten Zellen in einem Netzwerk und eine Abschätzung des Bereichs, den sie abdecken. Wir haben auch Werkzeuge, die bevorzugte Ausrichtung der Kupplung innerhalb eines Netzwerkes zu definieren und zu prüfen, ob die bevorzugte Ausrichtung in Richtung der Mitte des Kerns oder in eine andere Richtung entwickelt. Im Vergleich zu bisher verwendeten Methoden bietet dieses Protokolls ein Mittel zur Beschreibung der Organisation und Ausrichtung der astrocytic Netze in Strukturen wie der dorsalen trigeminus wichtigsten sensorischen Kern, die nicht über eine klare anatomische bekannt Abschottung. In den oben genannten Studien, die Netzwerk-Ausrichtung wird beschrieben als eine Beziehung auf die Form der Struktur selbst die bereits dokumentiert ist (zB., die Barreloid in den Thalamus, Fässer in der Hirnrinde “layers” im Hippocampus und Cortex, Glomeruli in die Riechkolben usw.). Darüber hinaus ermöglicht vektoriellen Analyse für Vergleiche der Kupplung Orientierungen unter verschiedenen Bedingungen aufgedeckt. Um zu analysieren, ob diese Parameter entsprechend der Position des Netzes innerhalb des Zellkerns geändert, entwickelten wir auch eine Methode, um jedes Netzwerk in Bezug auf die Grenzen des Kerns zu ersetzen. Diese Werkzeuge können leicht auf andere Bereiche für Ermittlungsbehörden Netzwerke von gekoppelten Zellen angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt eine Reihe von elektrophysiologischen Methoden um funktionelle Kopplung zwischen Astrozyten23,24zu beurteilen. Diese Methoden bieten jedoch keine Informationen über die anatomische Anordnung der astrocytic Netzwerke. Eine Reihe von Studien haben bereits gezeigt, dass “Farbstoff – oder Tracer-Kupplung”, wie hier, nur in einem Bruchteil der auftritt verbunden Zellen, die durch elektrophysiologische Methoden25,<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird finanziert durch Canadian Institutes of Health Research, Grant/Prämiennummer: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
Referências
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