Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz
Summary
Burada astrositik ağlar organizasyonu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Açıklanan yöntemi hücre sayısı, boyutu, alan ve bir çekirdek içinde pozisyon gibi bu ağların açıklayıcı ölçüleri sağlamak için önyargı en aza indirir. Anizotropi vektörel bir analizi ile değerlendirilir.
Abstract
Astrocytes nöronal fonksiyon sadece sinaptik ve tek hücre düzeylerinde, aynı zamanda ağ düzeyinde modüle giderek netlik kazanmıştır. Astrocytes güçlü boşluğu kavşak birbirine bağlı ve kaplin yoluyla bu kavşaklar dinamik ve son derece düzenlenir. Astrositik işlevleri uzmanlaşmış ve bunların ilişkili olduğu nöronal devre fonksiyonları için uyarlanmış bir ortaya çıkan kavramdır. Bu nedenle, astrositik ağların çeşitli parametreleri ölçmek için yöntemler daha iyi iletişim yöneten ve kaplin kuralları tanımlamak için ve daha işlevlerini anlamak için ihtiyaç vardır.
Burada, görüntü analiz yazılımı kullanarak (Örn., ImageJFIJI), astrositik ağlar boya-kaplin tarafından ortaya confocal görüntülerini analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemler 1) bir otomatik ve tarafsız algılanması için etiketli hücreleri, ağlar, 3) 4) ilgi alanı içinde ağının yeniden konumlandırma ve ağ içindeki yaymak boya Tercihli yönünü hesaplama hesaplama 2) olanak sağlar .
Bu analiz belirli bir alanda astrositik ağları karakterize, ağları farklı alanlar için farklı işlevler ilişkili karşılaştırmak veya bağlantı üzerinde farklı etkiler farklı koşullar altında elde edilen ağlar karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu gözlemler için önemli işlevsel konuları açabilir. Örneğin, biz nereye biz daha önce astrositik kaplin nöronlar tonik onların ateş desenlerini ritmik patlama1‘ e geçiş yapma yeteneği için gerekli olduğunu göstermiştir trigeminal çekirdeği, astrositik ağlar analiz. Boyutunu, lohusalık ve bu çekirdek astrositik ağlarda Tercihli yönünü ölçerek, onlar çemberlemek işlevsel etki alanları hakkında hipotezler inşa edebilirsiniz. Çeşitli çalışmalarda varil korteks, yanal üstün zeytin, koku glomeruli ve duyusal çekirdeği talamus ve bir kaç isim için görsel korteksin’de dahil olmak üzere çeşitli beyin bölgeleri benzer bir analizinden yararlanabilir öneririz.
Introduction
Birçok çalışma alt hücresel veya sinaptik düzeyinde nöron-astrocyte diyalog nöronal işlevleri ve sinaptik iletimi nasıl olabilir anlatmıştık. De astrocytes nöronal aktivite çevreleyen duyarlıdır kurulur; Aslında, onlar için glutamat, GABA, asetilkolin ve ATP (daha önce yayımlanmış değerlendirmeleri2,3,4bakınız) de dahil olmak üzere birçok nörotransmitter reseptörlerinin var. Buna karşılık, astrositik ensheath sinaptik öğeleri ve etkisi nöronal aktivite var ve extrasynaptic sitelerdeki ekstraselüler iyonik homeostazı düzenleyen ve çeşitli faktörler veya vericileri glutamat, D-serin ve ATP gibi serbest işler 5 , 6 , 7.
Astrocytes Ayrıca ağ düzeyinde nöronal fonksiyon modüle fikir, astrositik kaplin dağınık şekilde düzenlenmiştir ve karşılık gelen nöronal segmentasyon alanlarda açık anatomik tarafından karakterize kanıtlarla ortaya çıkmıştır Bölünebilme (gibi alanlarda duyusal temsilcilikleri ile), astrocytes diğer astrocytes aynı işlevi yerine sadece o kadar da yakın hizmet veren çift gösteren. İçinde varil korteks veya olfactoty glomeruli, astrocytes arasındaki iletişimi varil ya da glomeruli içinde çok daha güçlü ise yanal üstün olive, mesela en astrositik ağları uygun tonotopic eksen8‘ e, odaklı ve zayıf bitişik olanlar9,arası10. Her iki durumda da, astrositik ağlar glomerule veya varil9,10merkezine doğru odaklı vardır.
Biz son zamanlarda astrositik faaliyet nöronal ateş konsantrasyonu hücre dışı Ca2 + azaltarak gelen gösterdi ([Ca2 +]e), S100β, bir Ca2 +sürümü ile muhtemelen-protein11bağlama. Çekirdek (NVsnpr, masticatory hareketleri üretiminde önemli bir rol oynamaktadır düşünülen), sonuçları aslında trigeminal rhythmogenic nöronların trigeminal ana duyusal sırt kısmında bir popülasyondaki sunuldu bu etki bu Bu nöronlar ritmik ateş etmeye [Ca2 +]e11,12azalır tarafından teşvik bir kalıcı Na+ geçerli bağlıdır. Bu nöronlar ritmik ateş etmeye “fizyolojik” girişleri uyarılması veya yapay [Ca2 +]eazalma elicited. Biz daha fazla astrositik kaplin nöronal ritmik ateş1için gerekli olduğunu gösterdi. Bu olasılığını astrositik ağlar nöronal aktivite nerede senkronize ve koordine sinirlari belirli işlevsel etki alanları oluşturmak kaldırdı. Bu hipotezi değerlendirmek için ilk ciddi bir şekilde NVsnpr içinde bu ağların kuruluş belgelemek için bir yöntem geliştirmeye ihtiyacımız vardı.
Astrositik ağlarda önceki çalışmalar çoğunlukla kaplin cep telefonu numarasını ve yoğunluğu ve bölgeyi açısından ölçüde anlatmıştık. Astrositik ağlar şekli ve boya-kaplin yönünü değerlendirmek için girişimleri çoğunlukla iki eksen (x ve y) varil cortex9, hipokampus13,14, boyunca ağların boyutu karşılaştırarak gerçekleştirilmiştir 15, talamus16, yanal üstün zeytin8, koku glomeruli10ve korteks14barreloid alanlarında. Yöntem tanımlamak burada bir ağ etiketli hücrelerinin tarafsız sayıları ve çevrenin onlar kapağı bir tahmin sağlar. Ayrıca bir ağ içinde bağlantı tercih edilen yönünü belirtin ve tercih edilen yönlendirme merkezi çekirdeği veya farklı bir yöne doğru olup olmadığını değerlendirmek için araçlar geliştirdi. Önceden kullanılan yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu iletişim kuralı organizasyon ve dorsal trigeminal ana duyusal çekirdeği gibi bilinen bir açık anatomik var mı yapılarda astrositik ağlar yönünü açıklamak için bir yol sağlar. Bölünebilme. Yukarıdaki çalışmalarda, ağ yönlendirmesini şekil zaten belgelenen yapının kendisi bir ilişki olarak açıklanan (Örn., varil korteks, talamus barreloid katmanlar hipokampus ve korteks, glomeruli içinde olfaktör ampul, vb). Buna ek olarak, farklı koşullar altında ortaya yönelimleri kaplin karşılaştırmalar için vektörel analiz sağlar. Bu parametreler ağ çekirdek içindeki konumuna göre değişiklik olup olmadığını çözümlemek için Ayrıca her ağ referans olarak çekirdek sınırları değiştirmek için bir yöntem geliştirdi. Bu araçların kolayca diğer alanlar eşleşmiş hücre soruşturma ağlar için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astrocytes23,24arasında kaplin fonksiyonel değerlendirmek için elektrofizyolojik yöntemlerle bir dizi vardır. Ancak, bu yöntemlerin astrositik ağlar anatomik yerleşimi hakkında bilgi sağlar. Çalışmalar bir dizi zaten “boya – veya izleyici-olarak kancası”, burada, yalnızca bir kısmını içinde birleştiğinde düşündüren elektrofizyolojik yöntemleri25,26,27…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Kanada Enstitüleri Sağlık Araştırma tarafından Grant/ödül numarası finanse edilmektedir: 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
Referências
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
- Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control?. Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
- Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).
- Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neurociência. 286, 45-59 (2015).
- Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
- Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
- Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
- Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
- Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
- Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
- Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101–Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
- Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).
- Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).
- Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
- Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
- Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
- Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
- Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
- Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
- Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
- Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).
