Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.

Abstract

Kweken van Caenorhabditis elegans (C. elegans) in een grootschalige manier op agar platen kunnen tijdrovend en moeilijk zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope methode voor het verkrijgen van een groot aantal dieren voor de isolatie van proteïnen om door te gaan met een westelijke vlek, massaspectrometrie of verdere proteomics analyses. Een stijging van de nematode nummers voor immunostainings en de integratie van meerdere analyses onder dezelfde voorwaarden kweken kunnen bovendien gemakkelijk worden bereikt. Bovendien is een overdracht tussen platen met verschillende experimentele omstandigheden wordt vergemakkelijkt. Gebruikte technieken in plaat cultuur de overdracht van een enkele C. elegans met behulp van een platina-draad en de overdracht van bevolkte agar brokken met behulp van een scalpel. Met de toenemende nematode nummers, worden deze technieken echter overdreven tijdrovend. Dit protocol beschrijft de grootschalige cultuur van C. elegans met inbegrip van talrijke stappen om te minimaliseren van de impact van de bereiding van de monsters op de Fysiologie van de worm. Vloeistof en shear stress kunnen de levensduur van en metabole processen in C. elegans, waarvoor derhalve een gedetailleerde beschrijving van de kritische stappen om op te halen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten wijzigen. C. elegans is een modelorganisme, bestaande uit de neuronale cellen voor maximaal een derde, maar bij gebrek aan bloedvaten, waardoor de mogelijkheid te onderzoeken van uitsluitend neuronale wijzigingen onafhankelijk van vasculaire controle. Vroege neurodegeneratie in diabetische retinopathie bleek onlangs, voorafgaand aan vasculaire wijzigingen. C. elegans is dus van bijzonder belang zijn voor de studie van de algemene mechanismen voor diabetische complicaties. Bijvoorbeeld, een verhoogde vorming van advanced glycation eindproducten (leeftijden) en reactieve zuurstof soorten (ROS) is waargenomen, die reproducibly worden aangetroffen in C. elegans. Protocollen bij het behandelen van monsters van voldoende grootte voor een breder spectrum van de onderzoeken worden hier gepresenteerd wordt geïllustreerd door de studie van diabetes-veroorzaakte biochemische veranderingen. In het algemeen, dit protocol nuttig kan zijn voor studies die vereisen grote C. elegans getallen en in welke vloeibare cultuur niet geschikt is.

Introduction

Eiwit analyses, zoals een westelijke vlek of massaspectrometrie, vereisen milligram van eiwit. Deze opbrengst vereist een grote schaal kweken van honderden C. elegans, die kan worden bereikt door vloeibare cultuur of op solide media overzetten van de nematoden door wassen. Vloeistof en schuifspanning induceert de expressie van epitheliale natrium kanalen (ENaC), die zou kunnen de osmotische stress door middel van een verhoogde opname van natrium vergroten, potentieel veranderen de levensduur van C. elegans en beïnvloeden van metabole analyses¹ . Daarom nemen sommige kritische stappen in dit protocol voor de plaat gebaseerde benadering de vermindering van stress op het gebied van experimentele variabiliteit in aanmerking. Vloeibare cultuur, aan de andere kant, van invloed op het fenotype van de nematoden en bemoeilijkt de cultuur en collectie van een exact aantal aaltjes². Bovendien, reactieve stoffen kunnen worden gewijzigd door de media-onderdelen en ongelijk kunnen verdelen alvorens de nematoden. Met betrekking tot de beperkingen van vloeibare cultuur biedt dit protocol een alternatieve aanpak voor het kweken van grootschalige monsters van C. elegans.

C. elegans is een model-organisme met een verschillend netwerk van 302 neuronale cellen, die deel uitmaken van een derde van alle haar cellen³. Sinds de invoering ervan in wetenschap, veel homologe en orthologous genen zijn beschreven, zijn waarde als een model voor medisch onderzoek sturen. Onlangs, bewijs voor neurologische stoornis in diabetische retinopathie, voorafgaand aan vasculaire schade, heeft ingediend⁴. C. elegans ontbreekt bloedvaten, maar bevat een verschillende neuronale netwerk, waardoor het een geschikt model te onderzoeken van neuronale wijzigingen afgezien van vasculaire ones. C. elegans is dus van bijzonder belang zijn voor de studie van de algemene mechanismen voor diabetische complicaties. Biochemische wijzigingen in diabetische complicaties betrekking hebben op de vorming van AGEs, die verder de vorming van ROS in reactie op hyperglycemie^{5 beïnvloeden}. Leeftijden zijn te vinden in C. elegans en bijdragen tot de neuronale schade⁶. Chronische ziekten worden vaak veroorzaakt door complexe, polygeen processen, die een multiparametric aanpak vereisen voor de beoordeling van hun onderliggende mechanismen, zoals hier wordt geïllustreerd met de beoordeling van diabetische complicaties. Dit protocol kan worden gebruikt voor het verkrijgen van meerdere parameters tegelijk, en vervolgens. Meer vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid van een multiparametric benadering kunnen worden bereikt door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.

Protocol

Opmerking: Dit protocol is verdeeld in vijf secties. In de secties 1 – 3: het belangrijkste protocol bij C. elegans cultuur op grote schaal wordt gepresenteerd. Secties 4 en 5 bieden aanvullende protocollen voor de beoordeling van blijkt metabolieten die zich voordoen in diabetische metabolieten. In detail beschrijft sectie 1 een algemene grootschalige cultuur op platen. Deel 2 richt zich op de overdracht van grote hoeveelheden van C. elegans, terwijl sectie 3 wordt uitgelegd het oogsten van een groot…

Representative Results

Voorbeelden van het maken van een grootschalige C. elegans cultuur hier voor toepassingen in onderzoek naar diabetes worden gepresenteerd. Het is van belang de parameters op een enkel dier betrekking heeft, in plaats van te normaliseren het bij de eiwitconcentratie totaal. In een bepaling waarin een klein aantal aaltjes, kan dit eenvoudig worden bereikt door het tellen van de nematoden. Voor een grootschalige C. elegans cultuur waarbij honderden nematoden per experimente…

Discussion

Dit protocol biedt een betrouwbare benadering voor het grootschalig kweken van C. elegans om kwantitatieve resultaten te verkrijgen. Bevindingen uit de literatuur kunnen worden gerepliceerd, zoals wordt weergegeven in de Resultaten van de vertegenwoordiger. Hoewel dit protocol voor grootschalige monsters van C. elegans een rechttoe-rechtaan-methode lijkt, zijn er bepaalde valkuilen rekening te houden. Met betrekking tot de synchronisatie van de nematode bevolking beschrijft dit protocol…

Materials

E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.