En In Vivo musmodell åtgärd naiva CD4 T-cellsaktivering, spridning och Th1 differentiering induceras av benmärgen-derived dendritiska celler
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för i vivo bestämning av naiva CD4 T cell (T cell) aktivering och spridning Th1 differentiering induceras av GM-CSF benmärg (BM)-härledda dendritiska celler (DCs). Dessutom beskriver det här protokollet BM och T-cell isolering, DC generation och DC och T-cell överföring.
Abstract
Kvantifiering av naiva CD4 T cellaktivering, proliferation och differentiering till T helper 1 (Th1) celler är ett användbart sätt att bedöma den roll som T-celler i ett immunsvar. Det här protokollet beskriver i vitro differentiering av benmärgen (BM) föräldraparets att erhålla granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF) härrör-dendritiska celler (DCs). Protokollet beskrivs också överföringen av äggalbumin peptid (OVAp)-laddade GM-CSF-härledda DCs och naiv CD4 T-celler från OTII transgena möss för att analysera den i vivo aktivering och spridning Th1 differentiering av den överförda CD4 T-celler. Detta protokoll kringgår begränsning av rent i vivo metoder som införts av oförmågan att specifikt manipulera eller Välj studerade cell befolkningen. Detta protokoll tillåter dessutom studier i en in-vivo -miljö, därmed undvika förändringar till funktionella faktorer som kan uppstå i vitro och med påverkan av celltyper och andra faktorer som bara finns i intakta organ. Protokollet är ett användbart verktyg för att skapa förändringar i DCs och T celler som ändra adaptiva immunsvar, potentiellt ge viktiga resultat för att förstå ursprunget eller utvecklingen av många associerade sjukdomar.
Introduction
CD4 T-celler och antigenpresenterande celler (APC) såsom DCs är krävs medlare av immunitet mot mikrobiella patogener1,2. I perifera lymfoida organ aktiveras CD4 T-celler vid erkännande av specifika antigener presenteras av trupptransportfordon3,4,5. Aktiverade CD4 T-celler föröka sig och differentiera i olika specifika effektor Th-celler som är nödvändiga för utvecklingen av en rätt adaptiva immunsvaret6,7. Kontroll av dessa processer är kritiska för att producera en tillräcklig adaptive defense som dödar patogen utan att producera skadliga vävnad skada8. Th-celler definieras enligt uttryck eller produktion av ytan molekyler, transkriptionsfaktorer och effektor cytokiner och utföra grundläggande och precisa svar på patogener1. Cellerna av delmängden Th1 cellen uttrycka transkriptionsfaktor T-bet och de cytokiner interferon γ (IFNγ) och delta i värd försvar mot intracellulära patogener1. Kvantifiering av naiva CD4 T cellaktivering och spridning Th1 differentiering är ett användbart sätt att bedöma T celler rollspelet i ett immunsvar.
Detta protokoll möjliggör i vivo analys av in vitro –kapacitet genereras BM-derived DCs att modulera den aktivering och spridning Th1 differentiering av naiva CD4 T-celler. Protokollet tjänar också till att utvärdera kapaciteten hos naiva CD4 T-celler till vara aktiverat, inducerad föröka och Th1 differentierade (figur 1). Detta mångsidiga protokoll kringgår oförmågan att specifikt manipulera eller Välj studerade cell befolkningen i rent i vivo protokoll. Effekterna av olika molekyler och behandlingar på DCs kan studeras med BM från genetiskt modifierade möss5 eller genom att behandla eller att genetiskt manipulera isolerad BM celler9. Likaså kan T cell Svaren utforskas genom att erhålla T-celler för överföring från olika källor eller efter flera manipulationer3,8,10.
De främsta fördelarna med detta protokoll är tvåfaldigt. T-cellaktivering och spridning Th1 differentiering analyseras med ett flöde flödescytometri tillvägagångssätt. och detta kombineras med in-vivo studier, därmed avvärja förändringar som kan uppstå i vitro och inklusive celltyper och andra faktorer som endast finns i intakta organ11.
Användning av vitala färgämnen är en allmänt använd teknik att spåra cell spridning samtidigt som man undviker användningen av radioaktivitet. Mätning av spridning med dessa reagenser är baserad på dye utspädning efter celldelning. Dessutom dessa färgämnen kan upptäckas vid flera våglängder och analyseras enkelt av flödescytometri i kombination med flera fluorescerande antikroppar eller markörer. Vi belysa nyttan av detta protokoll genom att visa hur T cellaktivering och spridning Th1 differentiering kan analyseras med flödescytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll tillåter för karakterisering av BM-derived DCs förmåga att modulera den aktivering, proliferation och differentiering av naiva CD4 T-celler. Dessutom kan det också användas för att bedöma känsligheten av CD4 T-celler för modulering av BM-derived DCs. Med detta protokoll, kan förändringar i dessa händelser vara mätt i vivo.
Beroende på hypotesen under utredning, kan flera kombinationer av T-celler och DCs användas. Exempelvis kan man analysera konsekvens…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Simon Bartlett för engelska redigering. Denna studie stöddes av bidrag från Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet programmet och Fundación Ramón Areces; med medfinansiering från Fondo Europeo de Desarrollo regionala (FEDER). CNIC stöds av ministeriet för ekonomi, industri och konkurrenskraft (MEIC) och stiftelsen CNIC Pro och är en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF är grundat av Fundación Ramón Areces och CNIC, VZG av ISCIII, BHF av Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) och JMG-G av ISCIII Miguel Servet Program och imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
Referências
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
