La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea
Summary
Il modello murino di frattura femorale chiusa è una potente piattaforma per studiare la frattura che guarisce e nuove strategie terapeutiche per accelerare la rigenerazione dell’osso. L’obiettivo del presente protocollo chirurgico è quello di generare fratture femorali chiuse unilaterale nei topi utilizzando un asta intramidollare in acciaio per stabilizzare il femore.
Abstract
Fratture ossee impongano un carico tremendo socio-economico sui pazienti, oltre ad interessare significativamente la qualità della vita. Strategie terapeutiche che promuovono la guarigione ossea efficiente sono inesistenti e in alto la domanda. Modelli animali efficace e riproducibile di guarigione di fratture sono necessari per comprendere i complessi processi biologici associati con rigenerazione ossea. Molti modelli animali di guarigione di frattura sono stati generati nel corso degli anni; Tuttavia, i modelli murini frattura recentemente sono emerso come potenti strumenti per studiare la guarigione ossea. Sono stati sviluppati vari modelli aperti e chiusi, ma il modello di frattura femorale chiusa si distingue come un metodo semplice per la generazione di risultati rapidi e riproducibili in modo fisiologicamente rilevante. L’obiettivo del presente protocollo chirurgico è quello di generare fratture femorali chiuse unilaterale in topi e facilitare una stabilizzazione post-frattura del femore inserendo un’asta di acciaio intramidollare. Anche se dispositivi come un chiodo o una vite offrono una maggiore stabilità assiale e rotazionale, l’uso di un asta intramidollare fornisce una sufficiente stabilizzazione per i risultati di guarigione coerente senza produrre nuovi difetti nel tessuto osseo o danneggiando vicini soft tessuto. La formazione immagine radiografica viene utilizzata per monitorare la progressione della formazione del callo, unione ossuta e successivo rimodellamento del callo osseo. Risultati di guarigione dell’osso sono tipicamente associati con la forza dell’osso guarito e misurati con test torsionale. Ancora, comprendere i primi eventi cellulari e molecolari connessi con la riparazione di frattura è fondamentale nello studio della rigenerazione del tessuto osseo. Il modello di frattura femorale chiusa in topi con fissazione intramidollare serve come una piattaforma attraente per studiare la guarigione di frattura ossea e valutare strategie terapeutiche per accelerare la guarigione.
Introduction
Le fratture sono tra le lesioni più comuni che si verificano all’apparato muscolo-scheletrico e sono associate con un carico socio-economico tremendo, compresi i costi di trattamento che sono progettati per superare $ 25 miliardi ogni anno in Stati Uniti d’America1, 2. Anche se la maggior parte delle fratture guarigione senza incidenti, la guarigione è associata con notevoli tempi di inattività e perdita di produttività. Circa il 5-10% di tutte le fratture si tradurrà in una guarigione ritardata o non-Unione, a causa di età o altre condizioni di salute croniche sottostanti, quali osteoporosi e diabete mellito3,4,5. Trattamenti farmacologico non approvati dalla FDA sono attualmente disponibile per promuovere la guarigione dell’osso efficiente e ridurre i tempi di recupero.
Guarigione della frattura è un processo complesso e altamente dinamico che coinvolge il coordinamento di più tipi di cellule. Quindi, una completa comprensione degli eventi cellulari e molecolari connessi con rigenerazione ossea è fondamentale per l’identificazione di bersagli terapeutici che accelerare questo processo. Come con altre malattie umane, l’istituzione di un modello animale altamente suscettibile e riproducibile è cruciale nello studio della guarigione ossea. Gli animali più grandi, come pecore e maiali, hanno proprietà rimodellamento osseo e biomeccanica simili agli esseri umani, ma sono costosi, richiedono tempi di guarigione sostanziali e non sono facilmente suscettibili di manipolazione genetica6. D’altra parte, piccoli modelli animali, come ratti e topi, offrono molti vantaggi, tra cui una facilità di gestione, bassi costi di manutenzione, cicli brevi di allevamento e un tempo di guarigione più brevi7. Inoltre, il genoma del mouse è completamente sequenziato, consentendo la rapida manipolazione e la generazione di varianti genetiche. Così, il mouse è un sistema potente modello per studiare la malattia umana, ferita e riparazione8. In esseri umani, comorbidità come l’osteoporosi e diabete mellito aumenta la probabilità di una guarigione ritardata. Un numero di modelli del mouse esistenti è disponibili per studiare gli effetti di comorbidità quali l’osteoporosi e diabete mellito sulla lesione ossea e guarigione. I pazienti affetti da osteoporosi hanno una formazione di osso contrassegnato in diminuzione durante le fasi successive di una frattura che guarisce9. Topi ovariectomizzati (OVX) esibiscono perdita rapida dell’osso e ossea ritardata guarigione simile a quella osservata nell’osteoporosi postmenopausale10,11. Inoltre, molti modelli murini di tipo I e tipo diabete di II imitare i fenotipi massa bassa dell’osso e frattura alterata guarigione visto in esseri umani11. Inoltre, modelli murini frattura servono come una piattaforma versatile per studiare i complessi processi biologici che si verificano nel callo ed esplorare nuove strategie terapeutiche che accelerano la rigenerazione del tessuto osseo.
Nonostante le differenze nella struttura dell’osso e del metabolismo, il processo generale di frattura ossea guarigione rimane molto simile in topi ed in esseri umani, che coinvolge una combinazione di endochondral e ossificazione intramembranous seguita da rimodellamento osseo. Ossificazione endochondral prevede il reclutamento di cellule progenitrici meno meccanicamente stabile nelle regioni che circondano il divario di frattura, dove si differenziano in condrociti che ipertrofia e mineralizzano la cartilagine per produrre un callo molle. La seconda ondata di cellule progenitrici infiltrarsi il callo e differenziarsi in osteoblasti maturi che secernono nuovo osso matrice12,13,14,15. Durante l’ossificazione intramembranous, progenitori sulle superfici endostali e periosteal direttamente differenziano in matrice secernenti osteoblasti e facilitano il superamento del divario frattura9,11,12 ,13. Insieme, il endochondral e intramembranous ossificazioni provocano lo sviluppo di un callo duro, che è ulteriormente rimodellato nel tempo per formare un forte osso secondario in grado di supportare carichi meccanici13,14 ,15. Nell’uomo sano, il processo di guarigione richiede circa 3 mesi, rispetto a solo 35 giorni in topi16.
Guarigione della frattura è stata studiata comunemente utilizzando sia modelli chirurgici aperti o chiusi17. Aprire approcci chirurgici, quali la generazione di un difetto criticamente dimensione o completare osteotomia, standardizzare la posizione della lesione e la geometria per ridurre le deviazioni causate da fratture comminute. Osteotomie servono come un eccellente modello per studiare il meccanismo di fondo dietro un non-Unione, perché la guarigione è spesso in ritardo rispetto alle fratture chiuse. Inoltre, una rigida fissazione esterna è necessaria per stabilizzare l’osso osteotomized, che significa che la rigenerazione dipenderà principalmente l’ossificazione intramembranous. Approcci chirurgici aperti utilizzano dispositivi quali chiodi di fissaggio, fascette e piastre di bloccaggio per fornire stabilità assiale e rotazionale all’arto fratturato; Tuttavia, tali dispositivi sono costosi e richiedono molto più tempo in chirurgia18,19,20,21. D’altra parte, i modelli chiusi sono stabilizzati con un dispositivo di fissazione intramidollare semplice, consentendo abbastanza instabilità stimolare la guarigione endochondral. Di conseguenza, modelli di frattura chiusa non imitare prontamente le condizioni di un non sindacale. Tecniche di fissazione interna, quali perni intramidollari, chiodi e viti di compressione, sono vantaggiosi in quanto sono a buon mercato, facile da usare e ridurre al minimo il tempo in chirurgia21,22,23. In alcuni casi, perni intramidollari sono inseriti prima della frattura, ma la flessione del perno intramidollare può portare all’angolazione o spostamento del femore fratturato, contribuendo a una dimensione variabile callo e guarigione. La posizione di frattura e la geometria sono più difficili da standardizzare in modelli chiusi, in cui vengono generate utilizzando un dispositivo di piegatura tre punti, in cui è caduto un peso sulla diafisi. Tuttavia, con la tecnica corretta, questo approccio chirurgico offre risultati rapidi e costanti. Inoltre, il modello di frattura chiusa serve come uno strumento clinicamente rilevante per studiare le fratture causate da elevata forza di impatto o stress meccanici22.
Questo protocollo chirurgico è stato adattato da metodi precedentemente descritti utilizzando un perno intramidollare per stabilizzare femori fratturati in ratti e topi22,24,25. In primo luogo, un ago intramidollare di piccolo diametro viene inserito attraverso la tacca di intracondylar per stabilire un punto di ingresso, e un filo guida è stato introdotto prima di generare una frattura trasversale al midshaft femorale utilizzando un tre-punto di gravità-dipendente dispositivo di piegatura. Dopo la generazione di successo di una frattura chiusa del femore, è incorporato un asta intramidollare di un diametro maggiore sopra il filo guida per stabilizzare il femore fratturato. Questo metodo evita il rischio di guarigione ritardata causata dall’angolazione del perno intramidollare durante la frattura, come il posizionamento della post-frattura asta permette per la stabilizzazione di riposizionamento e ottimizzata del femore ferito.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo di questa procedura chirurgica è di generare fratture femorali chiuse standardizzate in topi. Un vantaggio chiave di questo modello è che la fissazione interna avviene dopo la generazione della frattura, evitando in tal modo un’angolazione dello stelo intramidollare. Forse l’aspetto più critico di questo protocollo è la generazione di una frattura trasversale standardizzata al midshaft femorale, come la geometria di frattura dipende la forza di piegatura applicata e il posizionamento degli arti posteriori…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte del dipartimento della difesa (DoD) noi Army Medical Research e Materiel comando (USAMRMC) Congresso Regia Medical Research programmi (CDMRP) (PR121604) e istituti nazionale di artrite e patologie del sistema muscoloscheletrico e malattie (NIAMS), NIH R01 AR068332 a Uma Sankar della pelle.
Materials
| Oster Minimax Trimmer | Animal World Network | 78049-100 | |
| POVIDONE-IODINE | Thermo Fisher Scientific | 395516 | |
| OPHTHALMIC OINTMENT | Thermo Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Styker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific Corporation | TP-700 | |
| 1ml Sub-Q Syringe | Thermo Fisher Scientific | 309597 | |
| ENCORE Sensi-Touch PF | Moore Medical LLC | 30347 | Latex, powder-free surgical glove |
| PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles | Thermo Fisher Scientific | 14-826-49 | |
| Ultra-High-Temperature Tungsten Wire, | McMaster-Carr | 3775K37 | 0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long |
| 304 stainless steel, 24G thin walled tubing | Microgroup Inc | 304h24tw-5ft | |
| #15 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| #10 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | Serrated/Straight/12cm |
| Iris Forceps | Fine Science Tools | 11066-07 | 1×2 Teeth/Straight/7cm |
| Dissector Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-12 | Straight/Serrated/12cm/with Lock |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | Serrated/Straight/14cm |
| Tungsten Wire Cutter | ACE Surgical Supply Co., Inc. | 08-051-90 | ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips |
| 3-0 VICRYL Suture | Ethicon Suture | J423H | 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING |
| piXarray 100 Digital Specimen Radiography System | Bioptics, Inc | Cabinet x-ray system | |
| Einhorn 3-Point Bending Device | N/A | N/A | Custom Built |
Referências
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