Une mesure de chromatographie liquide à haute performance de kynurénine et acide kynurénique : biochimie sur la Cognition et sommeil chez le rat
Summary
Altérations dans les métabolites de neuroactive kynurénine voie (KP) sont impliquées dans les troubles psychiatriques. Enquête sur les résultats fonctionnels d’une altération kynurénine voie métabolisme in vivo chez les rongeurs peut aider à expliquer des nouvelles approches thérapeutiques. Le protocole actuel combine les approches biochimiques et comportementales afin d’étudier l’impact d’un défi de kynurénine aiguë chez le rat.
Abstract
La voie de la kynurénine (KP) de la dégradation du tryptophane a été impliquée dans les troubles psychiatriques. Plus précisément, l’astrocyte dérivé métabolite acide kynurénique (frederic), un antagoniste à deux N-méthyl-d-aspartate (NMDA) et α7 des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (α7nACh), a été impliquée dans des processus cognitifs dans la santé et la maladie. Comme cristano taux sont élevés dans le cerveau des patients atteints de schizophrénie, un dysfonctionnement au récepteurs cholinergiques et glutamatergiques est censé être causalement liée à la dysfonction cognitive, un domaine du noyau de la psychopathologie de la maladie. FREDERIC jouerait un rôle pathophysiologically important chez les individus atteints de schizophrénie. Il est possible d’élever cristano endogène dans le cerveau des rongeur de traiter les animaux avec la kynurénine bioprecursor direct, et des études précliniques sur des rats ont montré que cristano élévation aiguë peut avoir une incidence leurs processus d’apprentissage et de mémoire. Le protocole actuel décrit cette approche expérimentale en détail et combine un) une analyse biochimique de kynurénine sanguin et cerveau formation KYNA (à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance), des tests b) comportementaux pour sonder la hippocampe-dépendantes mémoire contextuelle (paradigme de l’évitement passif) et c) une évaluation du comportement de veille-sommeil [enregistrements télémétriques combinant l’électroencéphalogramme (EEG) et les signaux de l’électromyogramme (EMG)] chez le rat. Pris ensemble, une relation entre élevées cristano, sommeil et cognition est étudiée, et ce protocole décrit en détail une approche expérimentale à la compréhension des résultats de la fonction de kynurénine élévation et cristano formation in vivo chez le rat. Résultats obtenus par les variations de ce protocole permettra de tester l’hypothèse que le KP et frederic servent un rôle essentiel dans la modulation de sommeil et la cognition dans les États de santé et la maladie.
Introduction
Le KP est responsable de la dégradation de près de 95 % de l’acide aminé essentiel tryptophane1. Dans le cerveau des mammifères, kynurénine pris en astrocytes est métabolisé en la petite molécule de neuroactive cristano principalement par l’enzyme kynurénine aminotransférase (KAT) II2. CRISTANO agit comme un antagoniste des récepteurs NMDA et α7nACh dans le cerveau2,3,4, et également cible les récepteurs dont le récepteur d’hydrocarbures aryliques (AHR) et la G-protéine de signalisation récepteur couplé à la 35 (GPR35)5 ,6. Chez les animaux expérimentaux, élévations dans cerveau cristano ont démontré qu’amoindrir leurs performances cognitives dans un tableau de tests comportementaux2,7,8,9,10 . Une nouvelle hypothèse suggère que cristano joue un rôle important dans la modulation des fonctions cognitives en influant le comportement de sommeil-éveil11, soutenant ainsi davantage le rôle des molécules dérivées astrocyte dans la modulation de la neurobiologie du sommeil et cognition,12.
Sur le plan clinique, élévations cristano ont été trouvées dans le liquide céphalorachidien et tissus post-mortem du cerveau de patients atteints de schizophrénie13,14,15,16, un trouble psychiatrique débilitant caractérisée par des troubles cognitifs. Patients atteints de schizophrénie sont aussi souvent minées par les troubles du sommeil qui peuvent aggraver la maladie17. Comprendre le rôle du métabolisme de la KP et frederic en modulant une relation entre le sommeil et cognition, particulièrement entre l’apprentissage et la mémoire, peut conduire au développement de nouvelles thérapies pour traiter ces piètres résultats dans la schizophrénie et d’autres maladies psychiatriques.
Une méthode fiable et cohérente pour la mesure des métabolites KP est importante pour assurer que les recherches émanant de diverses institutions peuvent être intégrés dans la compréhension scientifique de la biologie de la KP. Actuellement, nous décrivons la méthodologie permettant de mesurer la kynurénine dans le plasma du rat et frederic dans le cerveau de rat par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le présent protocole, qui fait utiliser une détection fluorimétrique en présence de Zn2 +, a été développée par Shibata18 et plus récemment adapté et optimisé pour derivatize avec l’acétate de zinc 500 mM comme réactif postcolonne, permettant la détection de quantités de nanomolaires endogène, de frederic dans le cerveau11.
Pour stimuler la production de novo KYNA endogène comme décrit dans le présent protocole, la kynurénine bioprecursor direct est injecté par voie intrapéritonéale (i.p.) chez les rats. En combinaison avec les quotes-parts biochimiques pour déterminer le degré de production cristano, les impacts d’un kynurénine contestent sur la mémoire de l’hippocampe-dépendantes (paradigme de l’évitement passif) et l’architecture du sommeil-éveil (signaux EEG et EMG) est aussi enquête11. Une combinaison de ces techniques permet l’étude de l’impact biochimique et fonctionnel d’un kynurénine défi in vivo chez le rat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour une évaluation fiable de KYNA dans le cerveau après une administration périphérique kynurénine, il est essentiel de combiner et d’interpréter les expériences biochimiques et fonctionnelles. Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet aux nouveaux utilisateurs de mettre en place des méthodes efficaces pour mesurer la kynurénine de plasma et le cerveau cristano de rats. La mesure de kynurénine dans le plasma a confirmé l’injection précise et la mesure du métabolite cristano confirme la syn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La présente étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (R01 NS102209) et un don du Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
Referências
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