Endringer i kynurenine sti (KP) neuroactive metabolitter er innblandet i psykiske sykdommer. Undersøker funksjonelle utfallet av en endret kynurenine sti stoffskiftet i vivo i gnagere kan bidra til å belyse romanen terapeutiske metoder. Gjeldende protokollen kombinerer biokjemiske og atferdsmessige tilnærminger for å undersøke virkningen av en akutt kynurenine utfordring i rotter.
Den kynurenine sti (KP) av tryptofan fornedrelse har vært involvert i psykiske lidelser. Spesielt astrocytter-avledet metabolitten kynurenic syre (KYNA), opptrer på begge N-methyl-d-aspartate (NMDA) og α7 nikotinsyre acetylkolin (α7nACh) reseptorer, har vært innblandet i kognitive prosesser i helse og sykdom. Som KYNA nivåene er opphøyet i hjernen til pasienter med schizofreni, er en feil på glutamatergic og cholinergic reseptorer antatt å skyldes causally kognitive dysfunksjon, en kjerne domenet psykopatologi av sykdommen. KYNA kan spille en pathophysiologically betydelig rolle i personer med schizofreni. Det er mulig å heve endogene KYNA i gnager hjernen ved å behandle dyr med direkte bioprecursor kynurenine prekliniske studier i rotter har vist at akutt høyder i KYNA kan påvirke prosessene læring og hukommelse. Gjeldende protokollen beskriver denne eksperimentelle tilnærming i detalj og kombinerer en) en biokjemiske analyse av kynurenine blodet og hjernen KYNA formasjon (med høy ytelse flytende kromatografi), b) atferdsmessige testing for å undersøke den hippocampus-avhengige innholdsrettet minne (passiv unngåelse paradigme) og c) en vurdering av sove-våkne [telemetrisk opptak EEG (EEG) og eletromyografi (EMG) signaler] i rotter. Sammen et forhold mellom forhøyet KYNA, søvn og kognisjon er studert, og denne protokollen beskriver i detalj en eksperimentell tilnærming til å forstå funksjonen resultatene av kynurenine høyde og KYNA formasjon i vivo i rotter. Resultatene som oppnås gjennom varianter av denne protokollen tester hypotesen at KP og KYNA tjene avgjørende roller i modulerende søvn og kognisjon i helse og sykdom stater.
KP er ansvarlig for nedverdigende nesten 95% av essensielle aminosyren tryptofan1. I pattedyr hjernen metaboliseres kynurenine tatt astrocyttene i neuroactive små molekyl KYNA hovedsakelig av enzymet kynurenine aminotransferase (KAT) II2. KYNA fungerer som opptrer på NMDA og α7nACh reseptorer i hjernen2,3,4, og også mål signalering reseptorer inkludert aryl hydrokarbon reseptoren (AHR) og G-protein kombinert reseptor 35 (GPR35)5 ,6. I forsøksdyr, har forhøyninger i hjerne KYNA vist seg å svekke kognitiv ytelsen i en rekke atferdsmessige analyser,2,,7,,8,,9,,10 . En nye hypotese antyder at KYNA spiller en viktig rolle i modulerende kognitive funksjoner ved å påvirke sove-våkne atferd11, dermed ytterligere støtte rollen astrocytter-avledet molekyler i modulerende nevrobiologi søvn og kognisjon12.
Klinisk har høyder i KYNA blitt funnet i Cerebrospinalvæske og evaluering av hjernevevet fra pasienter med schizofreni13,14,15,16, en ødeleggende psykisk lidelse preget av kognitive hemninger. Pasienter med schizofreni er ofte plaget av søvnforstyrrelser som kan forverre sykdommen17. Forståelsen av KP metabolisme og KYNA i modulerende en relasjon mellom søvn og erkjennelse, særlig mellom læring og hukommelse, kan føre til utviklingen av romanen terapi for behandling av disse dårlige resultater i schizofreni og andre psykiske sykdommer.
En pålitelig og konsekvent metode for måling av KP metabolitter er viktig å sikre at forskningen fremvoksende fra ulike institusjoner kan integreres i vitenskapelig forståelse av KP biologi. For tiden beskriver vi metodene for å måle kynurenine i rotte plasma og KYNA i rotte hjernen av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Den nåværende protokollen, som gjør bruk av en fluorimetric i nærvær av Zn2 +, ble først utviklet av Shibata18 og mer nylig tilpasset og optimert for å derivatize med 500 mM sink acetate som etter kolonnen reagens, slik at gjenkjenning av endogen, nanomolar mengder av KYNA i hjernen11.
For å stimulere de novo endogene KYNA produksjon som beskrevet i stede protokollen, direkte bioprecursor kynurenine injiseres intraperitoneally (IP) i rotter. I kombinasjon med biokjemiske evalueringer å fastslå graden av KYNA produksjon, virkninger av en kynurenine utfordrer hippocampus-avhengige minne (passiv unngåelse paradigme) og sove-våkne arkitektur (EEG og EMG signaler) er også undersøkte11. En kombinasjon av disse teknikkene tillater studiet av biokjemiske og funksjonelle virkningen av en kynurenine utfordring i vivo i rotter.
For en pålitelig vurdering av KYNA i hjernen etter en ekstern kynurenine administrasjon er det avgjørende å kombinere og tolke biokjemiske og funksjonelle eksperimenter. Her presenterer vi en detaljert protokoll som tillater at nye brukere å etablere effektive metoder for å måle plasma kynurenine og hjernen KYNA rotter. Måling av kynurenine i plasma bekreftet nøyaktig injeksjon og måling av metabolitten KYNA bekrefter de novo syntese i hjernen. Det er flere fordeler av beskrevet fluorometric HPLC metode…
The authors have nothing to disclose.
Studien ble finansiert delvis av National Institutes of Health (R01 NS102209) og en donasjon fra Clare E. Forbes Trust.
Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alliance HPLC system | |||
E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
Empower software | Waters | 176706100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Passive avoidance box for rat | |||
Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |