Acellular og cellulær lunge modell å studere svulst metastasering

Summary

Her presenterer vi en protokoll for en ex vivo lunge kreft modell som etterligner trinnene av svulst progresjon og bidrar til å isolere en primære svulst, sirkulerende kreftceller og metastatisk lesjoner.

Abstract

Det er vanskelig å isolere kreftceller på ulike tidspunkter i svulst progresjon. Vi laget en ex vivo lunge modell som kan vise samspillet av kreftceller med en naturlig matrise og kontinuerlig flyt av næringsstoffer og en modell som viser samspillet av kreftceller med normal cellulære komponenter og en naturlig matrise. Acellular ex vivo lunge modellen opprettes ved å isolere en rotte hjerte-lunge blokk og fjerne alle celler ved hjelp av decellularization prosess. Den høyre hoved bronchus er bundet av og kreftceller plasseres i luftrøret av sprøyte. Cellene flytte og fylle den venstre lungen. Lungene er så plassert i en bioreactor der lungearterien mottar en kontinuerlig strøm av media i en lukket krets. Svulsten dyrket på venstre lunge er den primære svulsten. Kreftceller som er isolert i sirkulerende media sirkulerer tumorceller og kreftceller i høyre lunge er metastatisk lesjoner. Mobilnettet ex vivo lunge modellen opprettes ved å hoppe over decellularization prosessen. Hver modell kan brukes å besvare ulike problemstillinger.

Introduction

Kreft metastasering er skyldige bak de fleste kreft-dødsfall og utgjør den ultimate utfordringen til å bekjempe kreft. Det overordnede målet med denne metoden er å designe en protokoll for en fire-dimensjonale (4 D) cellekultur som har en dimensjon av flyt, i tillegg til tredimensjonale (3D) cellevekst. Det representerer de tre distinkte fasene av metastasering [dvs., den primære svulsten, sirkulerende kreftceller (CTCs), og metastatisk lesjoner].

De siste tre tiårene gitt forskere verden en enestående mengde informasjon å forstå mekanismene bak metastatisk progresjon i ulike kreftformer som forbedret utsiktene til en kur eller progresjon overlevelse. Klinisk forvaltning av noen kreftformer som brystkreft, forbedret betydelig¹; noen kreftformer, som lungekreft, har imidlertid fortsatt dårlig overlevelse². In vitro og i vivo dyremodeller har vært medvirkende i å generere ny innsikt i mekanismer som understøtter utviklingen av sykdommen. I de siste årene, celle linje-avledet xenografts (CDX) og pasient-avledede xenografts (PDX) har blitt viet mer interesse som de bevare mange relevante funksjoner til primære menneskelige svulst³, for eksempel vekst kinetikk, histologiske funksjoner, atferdsmessige egenskapene og respons på behandling. Hver modell har imidlertid begrensninger å forstå mekanismen av CTC dannelse og metastasering til en fjern orgel^4,5,6.

Nylig har utviklet vi en 4-D ex vivo lunge kreft-modell ved å bruke begrepet orgel reengineering og perfusjon-baserte cellekultur. Det etterligner menneskelige lunge kreft vekst ved å danne perfusable svulst knuter som vokser over tid med en lignende human kreft-utskilles protein produksjon⁷. Det representerer gene expression signaturen spår dårlig overlevelse hos pasienter med kreft og viser også en terapeutisk respons av tumor regresjon ved cisplatin behandling^8,9. Lunge modellen ble ytterligere endret slik at den kan danne metastatisk lesjoner. CTCs utvikle fra en primære svulst og intravasate seg er blodkar og extravasate i kontralateral lungene å danne metastatisk lesjoner¹⁰. Gene expression studier foreslå en tydelig uttrykk profil av den primære svulsten, CTCs, og metastatisk lesjoner og oppregulering av undergruppe av gener kreves for fenotypen¹⁰. Dette metastatisk skjer på grunn av tilstedeværelsen av biologiske sett hos pasienter med kreft. Fordelen med denne modellen er en naturlig matrise og arkitektur og en perfusjon av næringsstoffer som fører til dannelsen av svulst knuter. I tillegg gir det også en mulighet til å studere virkningene av ulike komponenter av svulst microenvironment eller narkotika på svulst progresjon over tid. Denne modellen kan brukes til å vokse en rekke kreftceller (lungekreft, brystkreft, sarkom etc.) i et laboratorium oppsett.

Protocol

Protokollene for dyreforsøk ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Houston Methodist Research Institute og utført i samsvar med alle reglene, gjeldende lover, retningslinjer og policyer. 1. rotte lunge Harvest Bedøve en 4 – 6 uke gamle mannlig Sprague-Dawley rotten ved en intraperitoneal (IP)-injeksjon av ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) i sin flanke. Sikre anestesi ved å søke etter et fravær på bevegelsen når hind lem tå er tatt med tang….

Representative Results

Lungene høstet fra rotte opprettholder intakt blodkar og alveoler11 (figur 3A og 3B). På decellularization beholdes ekstracellulær matrix komponentene i en acellular lunge, som kollagen, fibronectin og elastin,11 (Figur 3 c, 3D, 3Eog 3F). Decellularization fører til en fullstendig fjerning av de opprinnelige rot…

Discussion

Ex vivo 4-D lungene gir en mulighet til å studere tumor vekst og metastasering i et laboratorium oppsett. En innfødt lung matrix er et komplekst system som gir støtte til normalt vev og opprettholder celle-celle interaksjoner, celle-matrix interaksjoner, differensiering og vev organisasjon. Det gir en mulighet til å legge til noen svulst microenvironment komponenter for å studere deres effekter på tumor vekst og samspill med andre celler.

Lunge innhøstingen er viktige skritt fo…

Materials

Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula