단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Summary

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

Abstract

Efferocytosis의 규칙을 공부 apoptotic 세포의 통풍 관을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis를 제어 하는 신호 및 세포 프로세스를 조사 하는 방법을 필요 합니다. 이 정량화 수행 apoptotic 세포 들은 efferocytosed 증분, 따라서 수 정확 하 게 윤곽을 그리 다 잔여 unengulfed 휴대 대 apoptotic 대상의 efferocytosed 부분 사이 방법이 필요로 하기 어려울 수 있습니다. 파편. 여기 설명 된 방법은 이중 라벨 접근 efferocytosis와 efferocytic 용량의 efferocytes 대 식 세포 등의 역학을 정확 하 게 계량을 활용 합니다. Apoptotic 세포의 cytosol apoptotic 세포의 표면 biotinylation 내 면 및 비 내 면 간의 차별화에 대 한 허용 하는 동안 모든 apoptotic 세포 유래 물질의 모니터링을 활성화 하는 셀 추적 염료와 함께 표시 됩니다. apoptotic 세포의 분수 Efferocytes의 efferocytic 용량 라이브 또는 고정 셀의 형광 이미지와 streptavidin 얼룩으로 구분으로 대 내 면된 대상, 바운드의 양을 측정 하 여 결정 됩니다. 이 방법은 cytometry, 즉 비-efferocytosed 대 efferocytosed apoptotic 세포 분수, efferocytic 역학 라이브 셀 현미경으로 측정 하는 능력의 정확한 묘사 같은 방법에 비해 몇 가지 장점이 고 용량을 붙일 레이블 transgenes 표현 하는 세포에 세포 신호의 연구를 수행 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법, efferocytic 활동을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis 동안 활성 세포 신호 경로 심문 하는 데 사용할 수 있는 유연한 실험적인 접근 방식 기반으로 제공 합니다.

Introduction

Apoptosis, 또는 프로그램 된 세포 죽음 대부분 다세포 유기 체에서 발생 하 고 그들의 발달 및 항상성¹에 대 한 중요 한 높은 규제 생리 적 과정 이다. 정상 세포 회전율 및 배아 개발에 참여 하 고, 이외에 apoptosis 조직에서 감염 되거나 손상 된 세포의 제거를 가능 하 게 하 고 또한 감염, 염증, 암, 응답 하 고으로 의료 개입에 의해 트리거할 수 있습니다. 방사선 치료 또는 스테로이드¹등. Apoptotic 세포 노출 “먹고-나” 다양 한 직업 및 비 직업적인 식 세포에 수용 체에 의해 인식 되는 그들의 세포 표면에 신호 총칭 하 여 “efferocytes”로. 이 수용 체의 참여 efferocytosis^2,3로 알려진 프로세스를 통해 efferocyte에 의해 통풍 관 및 apoptotic 세포의 저하를 유도 합니다. Phosphatidylserine은 최고의 특징이 먹고-저 운전 efferocytosis 신호. 그것은 일반적으로 apoptosis을 따라서⁴셀 표면 phosphatidylserine 노출이 막 비대칭 방해 지질 scramblase 활성화와 원형질 막의 내부 자료에 국한 된다. Phosphatidylserine은 성숙한 세포 등 일부 비 apoptotic 세포의 세포 외 표면에 있고 혈소판 활성화. 그러나,이 세포는 하지 “” 나를 안 먹는, 같은 신호 CD47, 그들의 세포 표면^5,,67의 존재로 인해 efferocytosed. 노출된 phosphatidylserine efferocytes에 의해 표현 하는 efferocytic 수용 체의 배열에 의해 인식 된다. Phosphatidylserine에이 수용 체의 바인딩을 직접 또는 opsonins의 원조를 통해 활성화 되 나 efferosome^8, 막 도약 공포에 apoptotic 세포의 engulfment를 홍보 하는 신호 통로 ^{9 , 10 , 11 , 12}.는 efferosome endosomes를 순차적으로 퓨즈와 리소좀, 분자 기계는 efferosome를 시 어 지 다 하 고 저하는 apoptotic 필요한 제공 셀 화물^13,14. 일단 저하, apoptotic 세포 유래 자료는 재활용 endosome에 인신 매매-apoptotic 세포 유래 항 원에 면역 응답을 제한 하 고는 apoptotic 세포^{13에서 영양분의 복구에 대 한 수는 프로세스 15}. Apoptotic 세포;의 장애인된 허가에 efferocytosis 결과에 실패 이러한 uncleared 세포는 결국 보조 괴 사를 받 다. 회 저 성 세포 프로-염증 성 cytosolic 내용, 병원 균, 그리고 autoantigens 따라서 감염, 염증, 자기 면역 질병^16,17의 연습장 extracellular 환경으로 풀어. 함께, apoptosis와 efferocytosis 죽어가는 및 죽은 세포의 제거를 촉진 하 고 조직의 항상성 유지에 대 한 허용.

Efferocytosis 기본 분자 메커니즘을 조사 apoptotic 세포 통풍 관의 명확한 정량화를 제공 하는 메서드가 필요 합니다. 이 정량화는 다른 글귀와 달리 endocytosis 및 먹어서^18,19, efferocytosis 메커니즘 발생할 수 있습니다 하지 증분 통풍 관의 결과로 그대로 목표 셀의 engulfment에서 사실에 의해 복잡 하 게 efferocyte²⁰apoptotic 세포. 여기에 설명 된 프로토콜 설명 생체 외에서 efferocytosis 분석 결과 내 면의 정확한 묘사를 제공 하는 개별 apoptotic 세포의 비 내 면 부분 대 고정 셀의 다양 한 결합 될 수 있다 및 라이브 셀 현미경에 접근 한다. 전통적인 먹어서 분석 추가 항 체 비 내 면 목표, 우리의 방법으로 레이블 하기 위해 실험의 끝에 phagocytic 대상에 특정 라벨 covalently 연결 biotin²¹ apoptotic 대상으로 다릅니다 ^{, 22}. apoptotic 세포 특정 항 체는이 분석 결과에 사용할 수 있는, biotinylation 접근 어떤 단백질 베어링 대상 표시를 허용 하 고 immunostaining 수행 하는 경우에 이차 항 체 분으로 잠재적인 문제를 피할 수 . 특히, 우리는 셀 추적 염료와 biotin 듀얼 얼룩이 있다 apoptotic Jurkat 세포의 준비 개요. 염료를 추적 셀 apoptotic 세포 유래 자료 efferocytosis 중 추적, 표면 biotinylation의 차별에 대 한 허용 하는 반면 efferocytosed apoptotic 세포의 비 내 면 부분에서 내 면화를 허용 합니다. 우리는 또한 문화 및 준비 J774.2 및 THP-1 셀 라인의 murine 인간과 efferocytes로 사용, M2 세포 monocyte 파생에 대 한 기본 셀 efferocytosis, 및 사용에 대 한 Jurkat 세포의 예를 들어 efferocytic 대상으로 설명합니다. 이러한 방법은 다른 세포 선 또는 1 차 셀, 대상 셀 (예: apoptosis, 괴 사 및 necroptosis), 세포 죽음의 어떤 형태를 겪고 그리고 지질 코팅을 통해 apoptotic 세포 시뮬레이션 미크론 크기의 모방에 쉽게 적용할 수 또는 특정 관심의 efferocytic 수용 체에 ligands와 코팅.

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 필드^23,24에 일반적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 방법 몇 가지 장점이 있습니다. 직접 식 apoptotic 세포 상호 작용, 모두 총 및 비 내 면 apoptotic 세포 물자의 명확한 라벨와 함께 영상으로 efferocytosis의 정량적 측정을 할 수 있다. 또한, pH을 구분 하지 않는 fluorophores의 사용 등 몇 가지 대체 방법을²⁵confounds lysosomal pH에서 FITC와 GFP 형광 억제 혼동 요인 제한 합니다. 마지막으로, 세부 사항에 설명 되지 않은, 하는 동안 이러한 방법을 채택 될 수 있다 transgenes 붙일 표시를 표현 하는 efferocytes를 사용 하 여 또는 후 고정 immunostaining, 신호 분자 활동 및 모니터링의 정량화를 허용 하는 efferocytosis 중 세포 프로세스입니다.

Protocol

건강 한 지원자에서 혈액의 컬렉션 건강 과학 연구 윤리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학에 의해 승인 되었다. Venipuncture 인간의 연구에 세 배 회의 정책 성명의 지침에 따라 수행 되었다. 1. 문화 및 THP 1 Monocyte 셀 라인의 준비 37 ° C + 5% CO2T25 플라스 크에서 현 탁 액 문화로 문화 THP 1 monocytes. 셀 소 태아 혈 청 (FBS) 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640) + 10%의 5 m…

Representative Results

밤새 Jurkat 세포의 apoptosis에 1 µ M staurosporine 결과 문화 > Annexin v (그림 1) 얼룩 확인 될 수 있다 세포의 95%. 비록 staurosporine의 농도 및 staurosporine 치료 기간 각 셀 라인에 대 한 최적화 될 필요가 있을 것 이다 다른 세포 유형,이 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 검색 및 efferocytosis의 정량화에 대 한 > 세포의 80%는 efferocytes에 그들을 추가 ?…

Discussion

이 프로토콜에서 설명 된 방법을 사용 이미징 및 고정 셀 및 라이브 셀 접근을 사용 하 여 동적 efferocytic 프로세스의 정량화. 이러한 방식을 일반적으로 고용된 흐름 cytometry 기반 방법^23,24에 여러 가지 이점을 제공합니다. 내부 고정 샘플 얼룩의 사용 속도의 더 강력 하 고 정확한 정량화와 efferocytosis의 범위를 제공 한다-실제로, 많은 교류 cytometry 기반 방…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152