Voorbereiding van een kwalitatief hoogwaardige primaire celcultuur van vis Pituitaries

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor te bereiden en handhaven van hypofyse en primaire celculturen van medaka (Oryzias latipes). De geoptimaliseerde voorwaarden in dit protocol rekening belangrijke parameters zoals temperatuur, osmolaliteit en pH door het nabootsen van de fysiologische omstandigheden van de vis, waardoor fysiologisch meer zinvolle resultaten.

Abstract

Primaire celculturen is een krachtig hulpmiddel gebruikt door wetenschappers bij het bestuderen van cellulaire eigenschappen en mechanismen van geïsoleerde cellen in een gecontroleerde omgeving. Ondanks de enorme verschillen in de Fysiologie tussen zoogdieren en vissen, zijn de protocollen van de cultuur van de primaire cel van vis vaak gebaseerd op zoogdieren kweekomstandigheden, vaak met slechts kleine wijzigingen. De ecologische verschillen van invloed zijn op niet alleen de lichaamstemperatuur, maar ook het bloedserum parameters zoals osmolaliteit, pH en buffercapaciteit van de pH. Als cel cultuurmedia en soortgelijke werkoplossingen zijn bedoeld om na te bootsen de kenmerken van de extracellulaire vloeistof en/of bloedserum waarnaar een cel aangepast wordt, is het van cruciaal belang dat deze parameters zijn aangepast specifiek aan het betrokken dier.

Het huidige protocol beschrijft geoptimaliseerde primaire kweekomstandigheden voor medaka (Oryzias latipes). Het protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe te isoleren en handhaven van gezonde losgekoppeld hypofyse cellen voor meer dan een week en bestaat uit de volgende stappen: 1. de aanpassing van de osmolaliteit de waarden gevonden in medaka bloedplasma, 2. de aanpassing van de incubatietemperatuur tot normale medaka temperatuur (hier in de aquarium faciliteit), en 3. de aanpassing van de pH en bicarbonaat buffer waarden vergelijkbaar met andere vissoorten leven bij soortgelijke temperaturen. De resultaten gepresenteerd met behulp van het protocol beschreven fysiologisch zinvolle resultaten voor medaka bevorderen en als een naslagwerk kunnen worden gebruikt door wetenschappers maken van primaire celculturen van andere diersoorten bij niet-zoogdieren.

Introduction

Cultuur van de cel is één van de belangrijkste instrumenten in moleculair biologisch onderzoek, biedt een uitstekende modelsysteem voor het beantwoorden van verschillende biologische vragen variërend van normale cellulaire fysiologie tot drug screening en carcinogenese¹gebruikt. Primaire cellen, rechtstreeks van het dierlijk weefsel met behulp van enzymatische en/of mechanische methoden, geïsoleerd worden vaak beschouwd als een meer biologisch relevant dan cellijnen als de biologische reactie dichter bij de in vivo situatie worden kan. Protocollen voor het voorbereiden van primaire celculturen moeten worden geoptimaliseerd voor elk soort en cel type van belang om te bootsen de kenmerken waarnaar een cel aangepast is en fysiologisch zinvolle resultaten te verkrijgen.

Talrijke protocollen beschrijven kweekomstandigheden voor zoogdiercellen systemen, terwijl soortgelijke protocollen beschrijven van primaire kweekomstandigheden voor vis cellen eerder schaars in vergelijking zijn. Cellen zijn gevoelig voor snelle veranderingen in de temperatuur, pH en de osmolaliteit, en zijn vooral kwetsbaar tijdens de procedure dissociatie. Commerciële zoutoplossingen en Kweekmedia gebruikt voor zoogdieren celculturen zijn niet optimaal voor teleost vis, met name wat betreft de pH buffer systemen en de osmolaliteit. Het is daarom belangrijk om te meten en aanpassen van de oplossingen voor fysiologisch relevante niveaus van deze parameters in de soorten van belang.

Primaire hypofyse culturen zijn gemaakt van verschillende vissoorten van de teleost, met inbegrip van de karper (Cyprinus carpio)^2,3, gras carp (Ctenopharyngodon idella)⁴, goudvis (Carassius auratus )⁵, regenboogforel (Oncorhynchus mykiss)⁶, Europese aal (Anguilla anguilla)⁷, tilapia (Labeo fimbriatus)⁸, zebravissen (Danio rerio)⁹, en Kabeljauw (Gadus morhua)¹⁰. Afgezien van het aanpassen van de incubatietemperatuur tot de soorten van belang, hebben verscheidene van deze protocollen de cellen bij zoogdieren-achtige omstandigheden die voor de soorten van belang, met een pH van 7,2 tot 7,5 in een bevochtigde sfeer suboptimaal zijn kunnen geïncubeerd. met 3-5% CO₂. Bovendien is het onduidelijk of de osmolaliteit van oplossingen gebruikt voor het voorbereiden van verscheidene van deze primaire celculturen werden aangepast en stabiel tussen verschillende oplossingen.

Het huidige protocol is gebaseerd op eerdere werk met primaire culturen van kabeljauw¹⁰ en omvat aanpassingen van incubatietemperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffer systemen, met inbegrip van de gedeeltelijke druk van kooldioxide (pCO₂), om te de Fysiologie van medaka (O. latipes). Medaka is een zoetwatervis van kleine (3-4 cm), inheems in Oost-Azië. Deze dagen, wordt het gebruikt als een soort model in veel onderzoekslaboratoria over de hele wereld, want het is relatief eenvoudig te kweken en zeer resistent tegen veel voorkomende vis ziekten¹¹. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van medaka als een model, met inbegrip van een temperatuur tolerantie van 4 – 40 ° C¹¹, een korte generatietijd, transparante embryo’s, een seks-bepalen gene¹², en een gesequenceerd genoom¹³, evenals veel andere beschikbare genetische hulpbronnen.

De primaire kweekomstandigheden in dit protocol worden geoptimaliseerd zodat deze overeenkomen met de temperatuur van 26 ° C die medakas worden bewaard in de vis-faciliteit. Verder is de osmolaliteit wordt teruggebracht van 320 mOsm/kg van kabeljauw leeft in zout water tot 290 mOsm/kg voor medaka leven in zoet water en is in overeenstemming met de normale osmolaliteit van medaka plasma¹⁴. In vergelijking is de typische osmolaliteit van zoogdieren plasma in het bereik van 275-295 mOsm¹⁵. Vissen leven in een verscheidenheid van temperaturen en hebben kieuwen die in direct contact met water, waardoor de pH en buffer capaciteit van het bloed en het extracellulaire vloeistof in vis afwijken bij zoogdieren. Zoogdieren voedingsbodems bestaan meestal uit buffer-systemen die leiden tot een pH van ongeveer 7.4 wanneer de media zijn geëquilibreerd aan een standaard sfeer van 5% CO₂ in bevochtigde lucht bij 37 ° C. De pH is afhankelijk van temperatuur en de waarde voor de verhoging van de neutrale pH (in water) met een dalende temperatuur-¹⁶. Typisch teleost vis plasma pH varieert van 7,7 7,9¹⁷. De optimalisering van dit protocol opgenomen een reductie van pH 7.85 voor kabeljauw bij 12 ° C tot pH 7,75 voor medaka gehouden bij 26 ° C door het verhogen van de CO-₂ van 0,5% tot 1% beperkt.

Daarnaast is de buffercapaciteit van bicarbonaat heel anders in vissen en zoogdieren. CO₂ gemakkelijk worden verzonden via de kieuwen in vis en de pCO₂ in water is slechts een klein deel van de pCO₂ in de Long-¹⁸. De temperatuur of de pCO₂ wijzigt, de pH en de buffer van het medium. Noch de pCO₂ aanbevolen voor het broeden van zoogdiercellen als de pH dus optimaal voor vis cellen, en daarom moet de voedingsbodems worden geoptimaliseerd met buffer systemen met fysiologisch relevante waarden voor vis en de bepaalde soorten van belang. Dit protocol beschrijft hoe te bereiden van primaire celculturen van medaka pituitaries en omvatten aanpassingen van de incubatie temperatuur, osmolaliteit, pH en pH buffersysteem, naast andere belangrijke parameters te overwegen bij de voorbereiding van de oplaadbare batterij bij niet-zoogdieren soorten culturen.

Protocol

De dierproeven uitgevoerd in deze studie werden goedgekeurd door de Noorse Universiteit van levenswetenschappen, volgende richtlijnen voor de zorg en het welzijn van dieren voor onderzoek. 1. bereiding van de oplossingen Kalibreren van de osmometer en pH meter instrumenten volgens de instructies van de fabrikant om de juiste metingen. Bereiden van 500 mL van Ca2 +- en Mg2 +-gratis Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (dPBS), 7,75 (sta…

Representative Results

Dit protocol beschrijving van de voorbereiding van een cultuur van de primaire cel van medaka pituitaries en gezonde cellen die kunnen worden gehandhaafd in een cultuur voor ten minste een week. Het protocol is gebaseerd op fysiologische relevante waarden voor medaka14 en bovendien aan de hypofyse weefsel in volwassen vis, met behulp van een pH van 7,75 en een osmolaliteit van 290 mOsm/kg gedurende de gehele procedure van het weefsel oogsten tot de vergulde is geop…

Discussion

In vitro cel cultuur systemen bieden krachtige hulpmiddelen voor onderzoekers een overvloed aan verschillende biologische vragen beantwoorden als gebruikt in de juiste manier¹. Het is belangrijk te onthouden dat gedissocieerde cellen die verloren hun verbindingen met de naburige cellen hebben verschillende functionele eigenschappen verkregen wellicht dan ze oorspronkelijk had in vivo. Om te voorkomen dat gevaar voor verkeerde uitleg van de resultaten uit in vitro experim…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D8537	Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.
L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	L5520	Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).
NaOH	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5881	Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.
NaHCO3	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5761	10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.
D-mannitol	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	63565	Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.
D-glucose	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	G5400	4.5 mM  D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.
GlutaMAX Supplement	Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)	35050-061	Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.
Penicillin-Streptomycin	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	P0781	Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin).
Trypsin type II-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T7409	Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T6522	Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below).
Dnase I	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D5025	Use in trypsin inhibitor solution (see above).
0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system	Corning Inc. (Corning, NY)	431097	Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.
35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-10-C	Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11254-20	Straigt tip
Dumont #5/45 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11253-25	Angled 45° tip
Stereo microscope SZ61	Olympus Corp. (Tokyo, Japan)		Use for dissection of pituitaries.
Alegra X-22R Centrufuge	Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)		With cooling option (similar to current model XR-30).
Water bath	Techne (Staffordshire, UK)		Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.
Pasteur glass pipettes	VWR (NY)	612-1701	Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.
Galaxy MiniStar table centrifuge	VWR (NY)	521-2844	Any small table centrigue will do.
Fine needles / insect pins	Fine Science Tools (CA)	26001-40	Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.
Wax plate			Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.