וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט
Summary
המטרה של פרוטוקול זה נועד להקל על המחקר של קולטני NMDA (NMDAR) בקנה מידה גדול יותר, לאפשר הבחינה של תופעות modulatory של מולקולות קטנות ושימושיהם טיפולית.
Abstract
N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) קולטנים (NMDAR) מסווגים רצפטורים גלוטמט ionotropic ויש תפקידים חיוניים בלמידה ובזיכרון. תקלה NMDAR, מבוטא כמו גם נגמר – או תחת – activity נגרמת על ידי מוטציות, ביטוי שונה, סחר או לוקליזציה, יכול לתרום מחלות רבות, במיוחד במערכת העצבים המרכזית. לכן, הבנה ביולוגיה של הקולטן וכן הקלת הגילוי של תרכובות מולקולות קטנות הוא מכריע המאמצים המתמשכים כדי להתמודד עם מחלות נוירולוגיות. לגישות ללמוד את הקולטן יש מגבלות כולל תפוקה נמוכה, עלות גבוהה של חוסר היכולת ללמוד יכולותיו פונקציונלי בשל נוכחותם הכרחי של חוסמי ערוצים כדי למנוע excitotoxicity בתיווך NMDAR. בנוסף, המערכות assay קיימים רגישים לגירוי על ידי גלוטמט בלבד, חסרי רגישות גירוי על-ידי גליצין, ליגנד שיתוף אחרים של NMDAR. כאן, אנו מציגים וזמינותו הראשון המבוסס על צלחת עם תפוקה גבוהה כוח ללמוד על קולטן NMDA עם רגישות ליגנדים שיתוף, גלוטמט, D-סרין/גליצין. גישה זו מאפשרת לימוד יצירות שונות של יחידת משנה NMDAR ומאפשר לימודי פונקציונלי של הקולטן במצבי גליצין – ו/או רגישים גלוטמט. בנוסף, השיטה אינה דורשת הנוכחות של מעכבי במהלך המדידות. ניתן להבחין את השפעות חיוביות ושליליות מאפננים allosteric עם זה וזמינותו, פרמקולוגיה הידוע של NMDAR כוכבנו במערכת שלנו. טכניקה זו גוברת על המגבלות של שיטות קיימות והיא חסכונית. אנו מאמינים טכניקה חדשנית זו. נאיץ את הגילוי של טיפולים בתיווך NMDAR פתולוגיות.
Introduction
עם ההתקדמות הנוכחית ברפואה, אמנם תוחלת החיים עלתה באופן משמעותי; עם זאת, אז יש השכיחות של מחלות הקשורות לגיל. מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כגון סכיזופרניה, נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, בין היתר, ללא יוצא מן הכלל, ההקרנות להגדיל מעל הבא העשור1, 2 , 3. לתפקודו של רצפטורים גלוטמט ionotropic המכונה קולטנים N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR) נקשר מחלת אלצהיימר סכיזופרניה, פגיעה מוחית טראומטית, שבץ מוחי, סוכרת, גלאוקומה בין היתר, אשר מצדיק צריך ללמוד את הביולוגיה שלהם לפיתוח טיפולים יעילים, מחלות שינוי4,5,6,7.
NMDARs מורכבים ארבע מונומרים או subunits4,8,9. ההרכב מבנית של NMDAR מראה השתנות התפתחותית ואזוריים בתוך המוח ה-7,10. NMDARs מעורבים פלסטיות סינפטית, קוגניציה, הדור של מקצבים נשימה, גפיים11,12,13. כערוץ ממותגת מתח, זה בעיקר הלא-ניצוח ב נח קרומית אפשרית (-70 mV), חסומה על-ידי מגנזיום כדי למנוע הסתננות של יונים. הערוץ מופעל על-ידי האיגוד של ליגנדים שני, גלוטמט, גליצין/D-סרין, דפולריזציה בו זמנית ב קרום סינפטית מתווך על ידי אמפא רצפטורים, מחלקת נוספת של רצפטורים גלוטמט ionotropic. דפולריזציה הסרת חסימה מגנזיום של NMDAR, הפעלת זרם של קטיונים, בעיקר סידן14,15,16. למרות הפעלת NMDAR חיוני להישרדות תא, הפעלת יתר יכול לגרום לתא המוות17,18,19 דרך excitotoxicity. זה, בנוסף האופי המורכב של הקולטן, הופך מאתגרת כדי לבצע מחקרים הדרושים לפיתוח טיפולים יעילים.
שיטות שונות פותחו כדי ללמוד את NMDAR. עם זאת, לכל אחד יש ליווי אזהרות. לדוגמה, טכניקה אחת נפוץ הוא מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד בתיווך NMDAR שינויים תאיים הסידן קו תא יציב תחת השליטה של טטרציקלין-inducible מקדם מכירות (ט-על)20. עם זאת, במערכת זו, supramaximal את ריכוזי ליגנדים הנדרשים הדרישה כי מעכבי NMDAR הן נוכח בזמן המדידה מקל כמעט בלתי אפשרי. לאתר הפעילות של אנטגוניסט תחרותי. במערכות דומות אחרות, הביטוי של הקולטן פונקציונלי גורמת רעילות, הדורשים חוסמי ערוצים כגון קטמין21,,22 , כדי לשמר על תרביות תאים. חוסמי ערוצים אלה לשבת בליבה של הקולטן, קשה לשטוף, במיוחד בתבנית המבוססת על צלחת, אז הם מפריעים מחקרים פונקציונלי של הקולטן. לבסוף, ב מדידות אלקטרופיזיולוגיות כגון תיקון מחבר חובק למעקה, יש תפוקה מוגבלת, מחקרים בקנה מידה גדול הם יקרים מאוד23. על אף האמור, המערכות הנ ל הן רגישות לגירוי גליצין; לפיכך, לומד גליצין תלוית פעילות של NMDAR הופך להיות אתגר.
כאן, אנו מתארים גישה מוזרה ללמוד NMDAR מתגבר על המגבלות שנדונו. הטכניקה שלנו הופך לרישית במערכת הביטוי baculovirus להביע את הקולטן ברמות פונקציונלי עם יחס מיטבי של subunits מעט ככל 16 שעות. יתר על כן, השימוש baculovirus מאפשר גישה קומבינטורית ופשוט, אשר מספק אפיון רחבה של סוגי NMDAR רקומביננטי המשנה ברורה. שלא כמו שאר מבחני, פרוטוקול זה אינו דורש חוסמי ערוצים בשל השימוש היריבים חלש. היתרון החזק ביותר של השיטה הזו שטיפה אחרי של אנטגוניסט חלש, הקולטן הוא רגיש אפנון של האתרים הבודדים גליצין ו גלוטמט-מחייב בנוסף אפנון כפול של גליצין/D-סרין והן גלוטמט ליגנד מחייב אתרים. וזמינותו recapitulates ידוע פרמקולוגיה של הקולטן NMDAR ואת ההשפעות של מאפננים הידוע שלה חיוביים ושליליים. לבסוף, מהדור הזה במבחנה הסלולר assay מתגבר על הסלולר רעילות הנגרמת על ידי זרם סידן מופרזת ומאפשר ללימודי פונקציונלי של הקולטן באופן תפוקה גבוהה, אשר יכולים להאיץ את התגליות של NMDAR מאפננים במצבי מחלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצלחת assay זו תלויה במידה רבה על בריאות התאים HEK בשימוש. תאים שעברו הצמיחה המעריכית, עם מספר נמוך המעבר אמור לשמש. Assay הזה כרוך העברות רבות, תוספות של פתרונות, זאת באמצעות התראה יבטיחו דיוק גבוה יותר בתוצאות שלה. ריכוזים של תרכובות וחומרים כל אחרים צריך להיות גם הצלבת למזער שגיאות. בעת החלפת המ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות סניף בגרות מלומדים תוכנית ומכונים נוברטיס למחקר ביורפואי בכללותה למימון מחקר זה.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
Referências
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease–systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging–need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
